聚合酶链反应(PCR)技术,彻底改变了世界分子生物学和更远的地方。在本文中,我们将讨论PCR简史及其原则,突显出不同类型的PCR和正在应用的特定目的。

PCR原则和历史

1983年,美国生物化学家Kary Mullis深夜开车回家时灵感的闪电袭击了他。他写的收据的想法最终授予他诺贝尔奖1993年化学奖。这个概念很简单:在实验室繁殖管发生在细胞的DNA复制过程。结果是一样的:新一代的互补DNA(互补)基于现有的链。

他使用的基础桑格的DNA测序为他的新技术作为起点。他意识到DNA聚合酶的重复使用触发连锁反应导致特定DNA片段的扩增。

他的想法基础的1976年发现耐热DNA聚合酶,Taq从细菌、孤立水生栖热菌在温泉中找到。¹TaqDNA聚合酶的最佳温度为72°C和长时间暴露于温度高达96°C,这意味着它可以容忍一些变性周期。

之前的发现Taq聚合酶,分子生物学家已经试图优化循环DNA扩增的协议,但是他们需要添加新的聚合酶在每个周期,因为所需的酶不能承受高温DNA变性。有耐热酶意味着他们可以多次重复放大过程不需要新鲜的聚合酶在每一个周期,使整个过程可伸缩,更有效率和更少的耗时。

第一个描述聚合酶链反应(PCR)使用Taq聚合酶在1985年发表在《科学》。²

1993年,美国fda批准的首个PCR设备市场。从那时起,PCR一直在稳步和系统改进。它已成为一个改变从法医证据分析和诊断,疾病监测和基因工程。这无疑被认为是最重要的一个科学进步的20倍^th世纪。

标准PCR实验概述

PCR用于扩增特定DNA片段从起始物料的复杂混合物DNA模板。样品制备和纯化协议依赖于起始物料,包括目标DNA的样本矩阵和可访问性。通常,最小的DNA纯化是必要的。然而,PCR确实需要知识的DNA序列信息的侧翼被放大(称为DNA片段目标基因)。

从实用的角度来看,PCR实验相对简单,可以在几个小时内完成。一般来说,一个PCR反应需要五个关键试剂:

DNA被放大:也叫PCR模板或模板DNA。这个DNA可以是任何来源,如基因组DNA (gDNA)互补,质粒DNA。

DNA聚合酶:所有PCR反应需要一个DNA聚合酶,可以在高温下工作。Taq聚合酶是一种常用的一个,它可以结合核苷酸60基地/秒的速度在70°C,可以放大5 kb的模板,使其适合标准PCR没有特殊要求。新一代的聚合酶被设计来提高反应的性能。例如,一些设计只有高温激活,以减少非特异性扩增反应的开始。别人把“校对”功能,重要的是,例如,当它是至关重要的,放大序列与模板序列完全匹配,比如在克隆。

引物:DNA聚合酶需要短的核苷酸序列来表示,他们需要开始放大。PCR,这些序列被称为引物和很短的单链DNA(约15 - 30基地)。当设计一个PCR实验,研究者决定了地区的DNA被放大和设计一对引物,一个在转发链和一个扭转,专门侧翼目标区域。引物PCR实验设计是一个关键的组成部分,应认真完成。引物序列必须选择感兴趣的目标独特的DNA,避免绑定到一个类似的序列的可能性。他们应该有类似的融化温度,因为链退火步骤同时发生。底漆的熔化温度可以影响基地的百分比,鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)相比,腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(T)与高GC含量增加熔化温度。调整引物长度可以帮助弥补这个匹配的一对引物。同样重要的是避免序列往往会形成二级结构或引物二聚体,这将降低聚合酶链反应效率。有很多可用的免费在线工具来帮助引物设计。

Deoxynucleotide三磷酸腺苷(核苷酸):这些作为构建块合成新的DNA链,包括四个基本的DNA核苷酸(dATP, dCTP、dGTP dTTP)。核苷酸通常添加到PCR反应的克分子数相等的数量最优基结合。

PCR缓冲:PCR缓冲确保维护整个PCR反应最佳条件。PCR缓冲的主要组件包括氯化镁(MgCl₂),tris-HCl和氯化钾(氯化钾)。MgCl₂作为DNA聚合酶的辅因子,而tris-HCl和氯化钾维持一个稳定的pH值在反应。

PCR反应在一个管进行混合上述试剂和放置在热循环管。

PCR扩增包含三个定义的时间和温度称为集步骤:变性,退火,扩展(图1)。

图1: 单一PCR循环的步骤。

每一个步骤,称为周期重复30 - 40次,,翻倍的DNA量在每个周期和获得放大(图2)。

图2: 的不同阶段和循环DNA分子通过PCR扩增。

让我们仔细看看每一个步骤。

1。变性

聚合酶链反应的第一步,称为变性,加热模板DNA多达95°C几秒钟,两个DNA链之间的氢键迅速打破。

2。退火

之后反应混合物冷却30秒到1分钟。退火温度通常是50 - 65°然而,C确切的最佳温度取决于引物的长度和序列。它必须仔细优化每一组新的引物。

这两个DNA链可以加入在这个温度,但大多数不因为混合物包含大量过剩的引物结合,或退火,在特定的模板DNA,互补的位置。一旦退火步骤完成,氢键将形成DNA模板和引物之间。此时,聚合酶准备扩展DNA序列。

3所示。扩展

然后温度提高到理想的工作温度的DNA聚合酶混合物,通常约72°C, 74°C的情况Taq。

每个引物的DNA聚合酶连接一端和合成新的股DNA, DNA模板互补。现在我们有四股DNA而不是开始时的两个礼物。

温度是提高了94年°C和双链DNA分子——“原始”分子和新合成的,变性成单个链。这denaturation-annealing-extension第二周期开始。在第二周期结束时,有八个单链DNA的分子。通过重复循环30次,双链DNA分子转化为在1.3亿年开始参加了新双链分子,每一个副本的区域开始分子由两个引物的退火网站。

来确定放大已经成功,PCR产品可能可视化使用凝胶电泳,指示扩增子的存在/没有,大小和近似丰富。这取决于应用程序和研究问题,这可能是一个实验的端点,例如,如果确定是否存在一个基因。否则,PCR产物可能是更复杂的下游的起点调查测序、克隆等。

聚合酶链反应的变化

由于他们的多才多艺,PCR技术近年来已经进化导致开发或几种不同类型的PCR技术。

最广泛使用的有:

实时定量PCR (qPCR)

最有用的一个定量实时PCR或qPCR发展。顾名思义,qPCR是定量技术,允许放大过程的实时监控和检测PCR产物。²它可以用来确定的起始浓度目标DNA,在许多情况下,否定了对凝胶电泳的需要。这是由于置入包含非特异性荧光染料,如SYBR®绿色当绑定到双链DNA,发出荧光,或DNA寡核苷酸sequence-specific荧光探针,等水解(TaqMan)调查和分子信标。DNA探针结合具体目标序列在福斯特的扩增子和使用原理生成荧光共振能量转移(FRET)通过耦合荧光分子一端和冷却器的另一端。荧光染料和探针,随着目标DNA的拷贝数量的增加,荧光水平增加比例,允许实时量化的放大与参考标准包含已知拷贝数(图3)。

qPCR使用专门的热循环仪配备荧光检测系统监测荧光信号的放大。

图3:例子qPCR放大图和标准曲线用于启用量化的拷贝数未知样本。

一(rt - pcr)

逆转录(RT) PCR和RT-qPCR是两个常用的PCR基因变异使病毒RNA转录分析和量化,在临床和研究环境。

RT是一个过程,使cDNA从单链RNA模板吗³,因此也被称为第一链互补脱氧核糖核酸的合成。rt - pcr的第一步是合成DNA / RNA RNA模板和DNA寡核苷酸引物之间的混合。逆转录酶酶催化这个反应然后降解RNA核糖核酸酶活动部分的混合动力车。随后,单链DNA分子合成的DNA聚合酶逆转录酶的活动。高纯度和质量起始RNA是必不可少的一个成功的rt - pcr。

rt - pcr可以执行以下两种方法:一步法rt - pcr和rt - pcr分为两步。在第一种情况下,RT反应和PCR反应发生在同一管,而在两步RT - PCR、两个反应分离和顺序执行。

反向transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)

上述反转录通常作为qPCR的第一步,量化RNA在生物样品(RNA转录或来自病毒RNA基因组)。

与rt - pcr,有两种方法为量化RNA RT-qPCR:一步RT-qPCR和两步RT-qPCR。在这两种情况下,RNA是第一个reverse-transcribed cDNA,用作qPCR扩增的模板。在两步方法中,逆转录和qPCR放大发生顺序作为两个独立的实验。一步法RT和qPCR执行同样的管。

数字PCR (dPCR)和数字滴PCR (ddPCR)

数字PCR (dPCR)是另一个适应原始PCR的协议。⁴像qPCR dPCR技术使用DNA聚合酶放大目标从复杂的DNA样本使用一套引物和探针。然而,主要的区别在于PCR反应的分区和数据采集。

dPCR和ddPCR基于限制稀释的概念。PCR反应分为大量nanoliter-sized sub-reactions(分区)。在每个液滴进行PCR扩增。PCR后,每个液滴与泊松统计分析,以确定的比例在原样品PCR阳性滴。一些分区可能包含一个或多个副本的目标,而其他人可能不包含目标序列。因此,分区分类为正面(目标检测)或负面(目标不是检测),提供一个数字输出格式的基础。

ddPCR是最近在2011年成为可用的技术。⁵ddPCR利用油水乳化形成单独的分区模板DNA分子。水滴本质上作为个人试管的PCR反应发生。

微流体聚合酶链反应

最近开发的微流体处理系统与巩膜和microchambers铺平了道路的实际应用范围,包括放大DNA通过PCR微流控芯片。

PCR芯片上执行受益于微流体的速度优势、灵敏度和低消费的试剂。这些特性使得微流体PCR特别呼吁快速检测,例如,对于诊断应用程序。从实用的角度来看,样品流经微流体通道,反复传递三个温度区反映了PCR的不同步骤。它只需要90秒10μL示例执行20 PCR循环。⁶随后的分析可以很容易进行了片外。

PCR故障排除

不同的PCR方法都有优点和缺点,影响应用程序适合⁷。这些都是总结在表1。

方法	优势	限制
聚合酶链反应	·简单的PCR来执行 ·低成本的设备和试剂 ·几个下游应用程序(例如,克隆)	·结果只是定性 ·post-amplification分析要求增加的时间和错误的风险 ·产品可能需要经测序
qPCR	·产生定量结果 ·探测器使用可以确保高特异性 ·高灵敏度分析 ·低周转时间 ·消除post-amplification分析要求	·需要更多的昂贵的试剂和设备 ·更少的引物和探针选择的灵活性 ·不服从其他下游产品确认分析(比如排序)由于小扩增子的长度 ·不适合等下游应用克隆
rt - pcr和RT-qPCR	·可以用于所有的RNA类型	·RNA是容易降解 ·RT步骤可能会增加时间和潜在的污染
dPCR和ddPCR	·快 ·没有DNA纯化步骤 ·提供绝对量化 ·增加灵敏度检测目标在有限的临床样本 ·高度可伸缩	·昂贵的 ·根据一些统计假设
微流体聚合酶链反应	·加速PCR过程 ·减少试剂消耗 ·可以用于高吞吐量 ·便携式设备的即时应用程序 ·允许单细胞分析	·仍然很新技术 ·需要广泛的样品制备清除残骸和不必要的化合物 ·限制选择材料的微流体装置由于高温

表1:不同的PCR方法的主要优点和缺点。

PCR输出应用程序

PCR技术已经成为不可或缺的工具在现代分子生物学和彻底改变了科学研究。这项技术也打开了细胞和分子的调查过程以外领域的分子生物学,因此在许多学科科学家还发现效用。

虽然PCR本身就是一个强大的独立的技术,它也被纳入更广泛的技术,如克隆和测序,一个小但是这些工作流的重要组成部分。

PCR的研究应用程序包括:

基因转录- - - - - -PCR可以检查基因转录的变化在细胞类型中,组织和生物体在一个特定时间点。在这个过程中,RNA分离出感兴趣的样品,和reverse-transcribed互补脱氧核糖核酸。最初的特定基因的RNA水平可以量化的互补脱氧核糖核酸扩增PCR。

基因分型- - - - - -PCR可以检测等位基因序列变化的特定的细胞或生物体。一个常见的例子是转基因生物的基因分型,如淘汰赛和敲入小鼠。在这个应用程序中,引物的设计是为了增强转基因部分(转基因动物)或突变(变异动物)。

克隆和突变- PCR克隆是一种广泛使用的技术在双链DNA PCR扩增片段的插入到载体(如gDNA, cDNA、质粒DNA)。这为例,就可以创建的菌株遗传物质已被删除或插入。定点诱变还可以用来介绍通过克隆点突变。这通常使用一种被称为的技术重组PCR,重叠引物是专门设计用于将基地替换(图4)。这种技术也可以用来创建小说基因融合。

图4:图描绘重组PCR的一个例子。

测序 - PCR可以用于丰富模板DNA测序。PCR准备的推荐的类型叫做高保真PCR和测序模板能够维持DNA序列的准确性。桑格测序,然后纯化,扩增片段菌进行基因测序反应中运行。在下一代测序(门店),使用PCR在图书馆准备阶段,DNA样本由PCR丰富增加数量和标记开始测序适配器允许多路复用。桥PCR也是第二代门店测序过程的一个重要组成部分。

作为一个独立的技术主力在其他方法,PCR改变了一系列学科。这些包括:

遗传研究全球- PCR在大多数实验室使用。最常见的应用之一是基因转录分析⁹旨在评估是否存在大量的特定基因转录。这是一个强大的生物技术在操纵基因序列——动物、植物和微生物——通过克隆。这使得基因或部分基因的插入,删除或变异在遗传标记工程师改变表型,阐明基因功能和开发疫苗等等,不一而足。PCR、PCR可用于检测序列变异的等位基因在特定的细胞或生物体。它的使用并不局限于人类。基因分型植物在农业协助植物育种者在选择、提炼和提高种畜。PCR也丰富测序样品的第一步,正如上面所讨论的。例如,大多数的映射技术人类基因组计划(HGP)依赖于PCR。

医学和生物医学研究- PCR用于大量的医学应用,从疾病有关的基因突变,诊断检测到传染性病原体的识别。PCR用于医疗领域的另一个很好的例子是产前基因检测。产前基因检测通过PCR可以识别胎儿染色体异常和基因突变,给准父母重要信息是否他们的孩子有一定的遗传疾病。也可以用作PCR屏幕胚胎植入前胚胎遗传学诊断的工具在体外受精过程。

法医科学——我们的独特的基因指纹意味着PCR可以亲子鉴定测试和仪器法医调查确定样品的来源。小的DNA样本与犯罪现场可以与DNA数据库或与嫌疑人的DNA,例如。这些程序真的改变了警方调查的方式进行。真实性测试也利用PCR基因标记,例如,确定物种的肉。分子考古学也利用PCR扩增DNA从考古遗迹。

环境微生物学和食品安全- PCR检测病原体,不仅在病人的样本矩阵也像食物和水一样,是非常重要的诊断和预防传染病。

PCR是基准技术检测核酸在每一个区域,从生物医学研究法医学应用。Kary Mullis的想法,写在收据的路边,原来是革命性的。

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