冰冻的新边界：冷冻保存进展

Cryopreservation，在零下的温度下冻结实时生物样品，唤起了科幻电影中长期旅程的科幻电影的场景，或者在未来可以治愈的未来中重新获得了绝症的人。尽管养育小说的人物显然仍然是哺乳动物的领域，但哺乳动物细胞培养，，，，primary cells，，，，组织，，，，microbes，，，，植物细胞系和种子，甚至整个生物，例如秀丽隐杆线蠕虫目前是可修正的，或者是冷冻保存的管道。冷冻护理整个哺乳动物或者gans尽管目前不可行，但是一个积极的扩展领域研究，可能增加器官移植物材料的可用性。

除了广泛的冷冻保存生物样本范围外，还有许多潜在的应用。冷冻保存是冻结生殖医学的潜在技术卵母细胞并正在调查银行生物多样性和保护工作的生物样本。在生物医学和生物学研究中，冷冻保存已在实验室中广泛使用，以支持宝贵的非商业细胞系和储存培养物，而在实验中没有积极使用。为了使技术更广泛地获得，冷冻保存研究正在取得重大进步，以克服冻结细胞，组织和器官在长期零下存储中固有的挑战。

基本挑战

“由于几个原因，冷冻水平的生物样本是一个复杂的过程。”乔纳森·莱克（Jonathan Lakey），在加州大学欧文分校的医学院和亨利·塞缪尔工程学院的名誉教授。冻结引起的冷冻币to cells, damage caused by the growth of intracellular ice crystals, which mechanically destroy cellular structures. Additionally, freezing causes changes to local cellular salt gradients, possibly triggering osmotic shock. These damaged, cryoinjured cells are less likely to survive upon thawing, defeating the purpose of cryopreservation,” elaborated Lakey. “Of course, cryoinjury can be abated by adding to the freezing medium a cryoprotectant, a substance that protects cells during the freezing process. Additionally, samples need to be cooled at an optimal rate and there are also特定于细胞的考虑因素，，，，which must be determined empirically to devise the best approach for the specific cell or tissue type. For instance, pancreatic islets and oocytes fare better with rapid cooling, whereas hepatocytes and hematopoietic stem cells require relatively slow cooling.”

正是这些特定于细胞的考虑因素使与单细胞样品更复杂的任何组装变得挑战。“困难的冷冻组织和器官有两个关键原因。”藏红花布莱恩特，澳大利亚RMIT的STEM科学学院研究员。“首先，组织和器官由可变大小的几种细胞类型组成，它们吸收冷冻保护剂并以不同的速度冻结。这些独特的质量和传热动力学necessitate different冷冻保存方案对于同一器官内的细胞。其次，尽管冷却介质的重要组成部分，但必须渗透到细胞以帮助它们冻结的冷冻保护剂通常也对细胞有毒。要冻结器官，需要将多层组织和器官中的所有层暴露于冷冻保护剂中。但是，将器官直接放入冷冻保护剂桶中，例如二甲基亚氧化物[DMSO]，当前的标准立即暴露于外层，在冷冻保护剂可以渗透到器官的核心之前，它们开始死于毒性。”

Keep it Cool: Cellular Cryopreservation for Clinical Applications

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两个比一个更好

许多研究集中在开发毒性较小或最好的无毒冷冻保护剂以改善冷冻保存的成功。莱克和他的团队调查了合并乙二醇的DMSO冷冻保护胰岛β细胞，该细胞可能会治疗患者1型糖尿病。“移植β细胞的过程仍然是最佳的，尽管埃德蒙顿协议与早期方法相比，获得相对较好的移植生存。移植受者接受免疫抑制方案以防止移植物排斥，但是这些免疫抑制药物对移植的β细胞有毒，该β细胞在解冻后处于脆弱状态。但是，如果可以开发出更好的冷冻保存方法，从而使β细胞在解冻时更加可行，那么这可能会改善其移植后的生存机会和免疫抑制疗法。”

将冰点细胞的正常DMSO浓度逐步添加至2M。1 M DMSO with 0.5 M ethylene glycol，Lakey和他的团队能够降低所需的冷冻保护剂的总浓度，从而降低了该冷冻保护剂混合物的整体毒性。接下来，他们在DMSO-乙二醇冷冻保护剂混合物中冻结了胰腺β细胞，并在2 m DMSO中冻结了胰腺β细胞，重新启动了细胞，并将其移植到缺乏β细胞的糖尿病小鼠中。如果移植的β细胞可行，它们开始产生胰岛素，一种调节分子的葡萄糖，该分子将糖尿病小鼠返回到正常血糖状态，这意味着正常的血糖水平。“结果非常令人鼓舞，”莱克回忆起这项工作。“我们发现在DMSO-乙烯甘油混合物中收到冻结的β细胞的糖尿病小鼠能够比仅在DMSO中收到相同数量的β细胞的小鼠早12天返回正常血糖。这些发现表明，β细胞在DMSO-乙烯乙二醇混合物中被冷冻保护时，β细胞比单独的DMSO更可行。继续改善冷冻保存会增加长期Beta细胞银行业务。”

布莱恩特还使用两种组件混合物进行了研究，称为深共晶溶剂，，，，as cryoprotectants. The components of deep eutectic solvents form a complex network of interactions, called hydrogen bonds, which lower the solution freezing point. Moreover, deep eutectic solvents are “glass formers”, meaning they form an amorphous solid upon freezing, instead of sharp crystals like water, rendering the solvents much less damaging to cells. “We tested six deep eutectic solvents to cryopreserve a mammalian cell line. Cells were then thawed, and we assessed their health using atomic force microscopy and confocal microscopy. We identified one deep eutectic solvent that was significantly less toxic than DMSO,” explained Bryant of her study, one of the first to methodically test these types of solutions as cryoprotectants for mammalian cells. “The candidate cryoprotectant mixture was less toxic than its constituents, underscoring the benefits of multi-component systems. Moreover, because the deep eutectic solvent was much less toxic than DMSO, cells could be incubated for hours at 37 °C without significantly lowering their viability upon reanimation.”

With such a low toxicity, the deep eutectic solvent could have potential applications for freezing organs prior to transplants. Unfortunately, at present, a significant number of consented organs from deceased individuals are不曾用过用于移植。无毒的冷冻保护剂的可用性可以通过冷冻器官来帮助解决此问题，直到需要移植，以防止浪费捐赠的样品。从理论上讲，在我们的深色溶剂中孵育器官不会杀死细胞的外层。因此，您可以等待它渗透到更深的层中，这将改善用冷冻保护剂冻结器官的成功。这是我们正在追求的研究途径。”

冷冻储存动物细胞培养物

维持生长的细胞培养的健康是一项艰巨的任务，这使得由于事故或污染的永久损失风险而变得更加困难。下载本指南，以了解有关冷冻细胞培养物的优势，细胞冷冻期间的一般事件以及细胞冷冻的实际方面的更多信息。

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封装以保护

Lakey和他的团队已经测试了另一种方法以改善冷冻保存的方法是将β细胞封装在藻酸盐层中，从中分离出的吸水胶凝聚合物棕色海藻。“该项目背后的理由是，藻酸盐生物材料将用作胰岛β细胞周围的防护涂层，从而改变了冷冻保护剂渗透的动力学，并最大程度地减少了毒性和暴露。藻酸盐膜还可以通过提供另一层将它们固定在一起来保护细胞，”详细说道。实际上，封装增强了解冻后的β细胞存活和功能。当移植时，在冷冻保存糖尿病小鼠之前已将其固定在藻酸盐中的β细胞比未在冷冻之前未封装的β细胞快了几乎两个星期。莱克总结说：“这绝对是一种有前途的方法，可以改善胰岛的冷冻保存方案。”

冰冻的未来？

当被问及未来的方向时，莱克回答说，需要针对特定​​单元格类型的定制协议。“我在我的职业生涯中在Beta细胞的职业生涯中做了很多工作，这些β细胞为1型糖尿病患者提供了潜在的医疗应用。但是，还有其他各种细胞类型，例如干细胞，免疫细胞，可以作为某些医疗状况的疗法有用。每种细胞类型都有不同的渗透动力学，因此需要定制的细胞保护剂。通过降低细胞保护剂的毒性，我们甚至可以实现组织和器官的冷冻。”

科比回应了这一观点，并认为毒性较小的细胞保护剂和定制的冰冻协议可能使器官有一天变成冰冻。她说：“我认为有两个关键方面会推进这一领域。”“毒性较小，因此可用于更广泛的细胞类型的新冷冻保护剂。而且，还有新技术，用于更均匀的冷却和加热。例如，微波和磁技术正在接受其他团体的调查，以促进更好的冰冻和解冻较大的样品，这是非常有希望的。”科比本人也在测试原始离子液体，，，，which, like deep eutectic solvents, are glass formers. “By tailoring the specific properties of these solvents, we can optimize them for cryopreserving various types of cells, and, hopefully one day, organs.”