测序一个核酸分子,如DNA或RNA,收益信息的核苷酸(腺嘌呤、胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤),提供生活所需的遗传指令。测序技术的发展源于开创性的著作沃特菲尔,弗雷德里克·桑格和雷吴在1970年代。¹几十年,方法和技术首次用于核酸序列穿过陡峭的发展:从阅读一个RNA分子,很可能整个生物体的基因组序列。²第一个人类基因组发表草案,在人类基因组计划,2001年³两年后完成。

商业DNA测序仪在1990年代末被生产出来。他们曾被称为第二代或新一代测序仪区别于第一个实验,并允许整个基因组的测序。在接下来的二十年里,测序仪经过快速发展,优化、不同区段,参数,如速度、准确性、测序深度和读取长度。⁴各种排序方法已经发展为特定的应用程序。而最近,其中最有趣的是单细胞测序。本文探讨了这一技术是如何工作的,它告诉我们什么。

什么是单细胞测序单个细胞RNA序列是什么?

传统的下一代测序(门店)考察了基因组的细胞群,如细胞培养、组织、器官或整个有机体。其输出的“平均基因组”的细胞群。另一方面,单个细胞的基因组测序措施单个细胞从一个细胞群。⁵如今,因此被称为传统的方法散装测序,以区别于单细胞技术。

单细胞测序技术目前可以用来测量基因组(scDNA-seq) DNA-methylome或转录组(scRNA-seq)人口的每一个细胞。这些技术被用来确定小说在癌细胞突变,探索进步表观基因组变异发生在胚胎发育和评估一个看似同质细胞的人口表达特定基因(图1)。⁶

图1: 使用单细胞测序技术,我们可以识别小说亚种群人口看似同质细胞内或细胞状态。)显示不同的方法可能展览heterogenicity细胞群。B)展示了细胞内人口可能识别和特征。

单细胞测序是如何工作的呢?

所有的单细胞测序技术都需要四个主要步骤(图2):

1)孤立的单个细胞的细胞群。

2)提取、处理和放大每个孤立的细胞的遗传物质。

3)准备一个“测序图书馆”包括一个孤立的细胞的遗传物质。

4)使用新一代测序仪测序的图书馆。

图2: 单细胞测序工作流程。 根据感兴趣的基因材料,样品制备过程略有不同。在所有情况下,然而,结果库的编码DNA测序材料、cDNA对于每个单元格,然后可以选择测序平台上测序。

孤立的细胞样本和基本处理

细胞可以使用不同的分离方法,^7,8的选择主要取决于样品的性质和处理步骤后细胞的孤立。每个方法的性能是由其定义的效率(有多少细胞可以孤立的单位时间),纯度(靶细胞收集的一部分)复苏(靶细胞收集的分数相比,最初的目标细胞总数可用)。让我们考虑最常用的技术。⁹

• Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)包括标记的细胞选择是基于细胞蛋白质荧光分子连接到有针对性的抗体。细胞内标记细胞透化作用可以访问使用。技术从而使得细胞基于多个参数的选择。然而,流式细胞仪需要> 10000细胞开始,和快速流可能损坏细胞的可行性。⁷
• Magnetic-activated细胞排序(mac)利用抗体介入超顺磁的纳米粒子标记特定的蛋白质在目标细胞。然而,这意味着,与流式细胞仪,只能用作目标细胞表面分子标记活细胞。¹⁰然后使用一个外部磁场分离标记细胞,而其他人则冲走了。因此,mac隔离的纯洁取决于用于标记的抗体的特异性和亲和力。
• 激光捕获显微解剖(LCM)用激光来隔离从固体靶细胞组织样本放在显微镜幻灯片。隔离可以通过两种方式:直接,当红外线传输激光能量不耐热的聚合物,特别是结合靶细胞;间接地,当紫外线脱落细胞。与流式细胞仪和mac,模块可用于完整的组织。也快速和可靠的。然而,中国大陆需要识别的靶细胞,通过目视检查他们的形态。细胞也可以切片在隔离期间,和紫外线会破坏DNA和RNA分子。¹¹
• 最后,人工细胞的选择,或精密控制,需要一个倒置显微镜结合micro-pipettes选择和分离目标细胞。精密控制被用于生活文化和胚胎细胞。然而,它的吞吐量是有限的,和中国大陆一样,技术要求熟练的专业人员正确识别靶细胞。¹²

细胞隔离的质量评估与图书馆准备在继续之前,和细胞的生存能力评估成像。RNA的完整性也可以评估,scRNA-seq分析尤其重要。孤立的细胞是细胞溶解。感兴趣的遗传物质(DNA或RNA)隔离和放大为后续检测单个细胞通常提供足够的产量只有极少量的DNA或RNA。由此产生的材料这些步骤是单链DNA,甚至scRNA-seq分析,在下一节中解释。许多协议开发处理需求和具体研究的局限性,如可用少量细胞。¹³

测序图书馆准备

放大DNA的测序时,它首先需要做成一个序列库。^13,14测序库是单链DNA片段的集合来自一个细胞群或,在单细胞测序的情况下,从一个特定的细胞。放大后,DNA片段是独一无二的条形码识别他们所属的起始细胞,和特定的适配器序列添加到5’和3’末端。此时,需要测序DNA部分通常是命名插入。条形码和适配器插入限制在一个或两个目的。都属于相同的DNA片段测序库编码使用相同的寡核苷酸序列。这允许池不同的库测序在一起在同一序列运行。适配器是与平台相关的,需要序列片段。商业工具可用于所有的样品和图书馆准备步骤。确保结果图书馆准确地再现了原始细胞的状态,描述了质量控制(图3)。¹⁵

图3: 质量控制评价图书馆准备和测序结果。在这个例子中,单个细胞已经被流式细胞仪分离。

测序

各种商用测序平台开发了稍微不同的方法。在这里,我们专注于综合排序方法,包括变化等焦磷酸测序和可逆的终结者测序。在排序之前,一个放大的步骤通常生成组DNA片段克隆(通常通过桥放大或乳液聚合酶链反应)。为每个组在测序克隆发出相同的信号,由此产生的集群或信号足够强的检测。¹⁶这种类型的测序通常发生在一个芯片,它可能包含micro-wells。适配器和其他分子聚合酶一样,绑定到芯片(或底部micro-wells)插入适配器连接并与之交互。然后插入测序需要多个复制步骤,执行的聚合酶和使用荧光标记的核苷酸。在每个周期中,一个单一的荧光标记核苷酸添加,如果合并的聚合酶,触发光发射特性的特定的核苷酸。光光谱同时发出所有的碎片都是通过相机在下个周期开始前,记录。每个核苷酸发出不同的光,音序器重建,逐周期,所有插入的序列。音序器也读插入的标记分配每个测量它适当的图书馆。

质子测序检测综合使用不同的排序方法。碎片通常绑定到珠子和放大每个珠(类似于焦)。然而,当基地被添加在排序过程中,而不是光和荧光标记版本,它会释放出一个质子,然后可以检测并记录。

另一个不太常见的测序方法通过结扎测序。这种方法使用DNA连接酶DNA聚合酶,而附加荧光标记的短序列的核苷酸。在排序之前,使用乳液聚合酶链反应扩增DNA片段通常放大化学。然后每个核苷酸的插入排序两次,这种方法提供了非常准确的读取。然而,测序结扎输出短只读取,不兼容回文序列。

类型的单细胞测序

单细胞测序技术可以测量不同类型的遗传物质- - - - - -基因组、转录组或methylome- - - - - -一个细胞。本节解释了样品制备的主要差异(图2)和最相关的应用程序这三个亚型测序。

单细胞基因组测序

通过确定单个细胞的基因组,scDNA-seq允许细胞的基因组异质性人口调查。¹⁷因此,它主要用于研究微生物和癌症。微生物是单细胞生物的社区,和sc赌欧洲杯赔率DNA-seq措施微生物基因组的组件不需要隔离并培养他们。测序数据可以用于研究微生物的组成,因此,其生态、进化和改变。^18,19在癌症研究中,scDNA-seq用于研究intra-tumor遗传异质性或识别小说致癌的变异。^20.,21由于这些创新能力,scDNA-seq显著提高精密医学的发展。²²

scDNA-seq,从孤立的细胞中提取的DNA是最经常使用多个位移放大放大(MDA)或多个退火和looping-based放大周期(MALBAC)。²³MDA允许微量DNA的快速放大,提供一个优秀的但不均匀的基因组覆盖率。MALBAC,另一方面,提供了一个减少但更甚至覆盖的基因组,因此更适合检测拷贝数变异。图书馆是生成的,如前所述,从放大DNA。这种方法要想成功,一个更高效的放大是至关重要的。但是,没有放大方法是完美的。特别是,检测单核苷酸多态性(snp)和拷贝数变化往往是非常低效的。现在已经发展了不同的放大方法,提高检测特定的突变类型。²⁴

单细胞转录组测序(单个细胞RNA序列、单细胞RNA-seq或scRNA seq)

scRNA-seq措施给定样本的每一个细胞内RNA分子。这些信息提供了一个快照的转录组(被转录的基因)细胞收获的时候。^25,26自发展以来,scRNA-seq发现各种各样的应用程序。虽然最终产品基因的表达是一种蛋白质,检测它的信使核糖核酸(mRNA)表明基因被开启,因此,有潜力成为随后翻译和表达。此外,co-transcribed基因可以用来推断基因调控网络,构成特定的细胞的表型。²⁷细胞的转录差异人口可以帮助识别亚种群,如肿瘤的恶性细胞。²⁸scRNA-seq也用于研究重要基因转录特征,如拼接模式和monoallelic基因转录。^29日,30.原核生物scRNA-seq已经出现等因素在细菌细胞和RNA信使RNA复制数字低不稳定。然而,方法是可得到的克服这些问题。^31日,32

孤立的细胞是细胞溶解,信使rna分子,腺苷酸,使用聚[T]引物纯度。这是一个关键的一步因为大多数RNA分子在细胞核糖体(rRNA):非常大,通常情况下,不转录组测序的对象。接下来,反转录酶转换保利[T]影射单链mrna为互补DNA(互补)。PCR或在体外转录(溶)然后使用放大互补脱氧核糖核酸分子。最后,条码标签和其他所需的短序列测序平台添加到互补脱氧核糖核酸分子。²⁶

这项技术的测序质量受到一些因素的影响,最主要的是图书馆的总数,可以从一个细胞群和发现读取。理想的细胞的数量取决于预期的许多不同的细胞亚群或状态。读取的数量表明了转录组测序,根据基因组的大小:更高的阅读深度提供了更可靠的细节。样品和图书馆准备协议也会影响结果的质量。

单细胞DNA methylome测序

DNA甲基化是一个甲基转移到胞嘧啶碳(通常是C5)。DNA甲基化是表观遗传机制,改变活动而不影响它的序列:当在一个基因启动子,DNA甲基化通常压制基因的转录。³³单细胞DNA methylome测序(scDNA-Met-seq)可以被用来研究表观遗传变化在一个人口否则基因相同的细胞,引起不同的表型。DNA甲基化也是至关重要的,细胞的身份和x染色体失活是关键,基因组印记,转位因子的镇压,衰老和致癌作用。这种技术主要用于发展研究,³⁴但也被用来探索罕见并且极其活跃的肿瘤细胞亚群。³⁵

样品和图书馆准备scDNA-Met-seq类似scDNA-seq与一个额外的步骤。亚硫酸氢放大之前,DNA进行转换,只有转换non-methylated胞嘧啶残基尿嘧啶,离开5-methylcytosine残留未受影响。³⁶然而,重亚硫酸盐处理DNA片段和降解。其他方法,如methylation-sensitive限制性内切酶,已经探索了但仍不可用单细胞测序。

分析单细胞测序数据

最后的原始输出音序器首次直接测序机内处理,返回二进制基地呼叫(BCL)文件和质量分数。基类库文件的原始测序在二进制格式输出。基类库文件进行进一步的分析,然后转换成FASTQ文件,包含序列信息的文本文件和质量分数(图3)。这一步通常在Linux服务器上进行多路分解后的数据从不同的库使用条形码标签。

FASTQ文件处理对齐模板基因组的序列,添加注释,检测变体,执行微分转录分析和可视化数据。^37,38几个第三方academic-developed脚本可用于执行这些初步分析。^39,40鉴于FASTQ数据文件的大小(通常10 - 200 g),大部分的这些分析计算昂贵,因此,通常表现在Linux服务器上使用命令行。结果数据可以使用数据进行进一步分析和统计工具,如数据归一化,主成分分析,t-distributed随机邻居嵌入分析,聚类分析和途径基因集富集分析。这些工具探索大型数据集时非常有用,因为他们允许意想不到的生物行为模式和识别,以及最重要的基因或转录驱动特定的表型。特别是,Bioconductor是一个杂物包为R统计编程语言开发的,提供免费、开源软件基因组数据的分析。⁴¹这个包中的工具设计执行上述分析和可视化结果。某些工作流程和功能已经专门为单细胞测序分析优化。^42,43

单细胞测序为什么重要?

每个细胞在一个组织或器官的贡献,以不同的方式,整个有机体的理疗/病理学。与单个细胞技术,我们可以调查每个细胞和测量其特定的贡献对整个细胞群,其生物或生态系统。这种独特的详细程度是特别有价值的学习时罕见的细胞或探索same-cell-type种群内的表型变化。例如,scRNA-seq已经被用于调查罕见的抗原T和B细胞,⁴⁴衡量人类微生物组的组成和结构,⁴⁵研究的起源和发展chemoresistant肿瘤亚种群,⁴⁶在植物组织中发现未知基因的功能,⁴⁷研究肿瘤恶化机制和预后预测基于intra-tumor细胞异质性。⁴⁸这些和更多的应用程序成为可能在各领域的单细胞测序技术的独特性。

与其他技术结合单细胞测序和单细胞技术

各种组学技术现在经常结合探讨多层单个细胞的状态。^49,50通过结合前面描述的测序技术,可以研究基因组、外遗传性和转录组风景在同一细胞的人口。^51,52测序技术也经常结合蛋白质组学方法,批量和单个细胞,包括代谢组学、phosphoproteomics, acetylomics glycoproteomics。^53,54结合不同的单个细胞组学方法可以达到一个更深的理解细胞的人口的异质性:更多的亚种群可能确定,其他技术可以挑选不同类型的变化。也是可能推断出功能变化观察到一组学技术之间的联系与观察到另一个地方。这些信息可以帮助确定新的因果关系,因此,一个已知表型背后的机制。

几种计算方法已经开发集成不同的组学数据集,^55,56包括创新、基于机器学习的方法。⁵⁷然而,算法集成multi-omics单细胞数据仍经常不足。虽然图书馆准备协议和测序技术已经极大地完善,数据分析工具落后,现在可能带来最大的挑战。

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