优化细胞疗法开发电穿孔

细胞疗法是一系列疾病的新型新型治疗选择，从遗传疾病到癌症。随着细胞疗法领域的扩展，对安全有效的方法的需求不断增长，以将外来遗传物质输送到细胞中。尽管电穿孔比基于病毒载体的细胞疗法开发的方法具有多种优势，但该方法可以提出挑战。

捷克葡萄牙直播had the pleasure of speaking with Thermo Fisher Scientific’s Don Paul Kovarcik, to learn more about the benefits and limitations of electroporation and key factors影响电穿孔性能。在这次采访中，科瓦尔奇克还告诉我们新的氙气电穿孔系统及其如何应对与电穿孔相关的挑战，包括如何保留细胞活力并促进缩放。

Zoe Braybrook(ZB): What are the key benefits of choosing electroporation as a transfection method for cell therapy development?

Don Paul Kovarcik（DK）：即使使用病毒转导进行了许多收养T细胞疗法的基础工作，但仍然存在一些局限性。第一，由于这些病毒在基因组中随机整合，并可能带来意想不到的后果。二，需要额外的测试，例如复制能干病毒。最后，有效载荷大小的限制可以通过病毒向量传递。

相反，电穿孔可用于提供多种有效载荷，包括DNA，RNA和蛋白质，包括大于10 kb的有效载荷。此外，电穿孔是提供基因编辑有效载荷的最常用方法。这些非病毒工程方法可以允许更具体和可控制的工程，因此有可能进行更好的治疗。

ZB：效率对于细胞疗法制造商而言至关重要。您能告诉我们更多有关氙气表现的信息吗？这与其他方法相比如何？

DK：虽然存在供体到谱系的变异性，但氙气能够在初级活化的T细胞中输送多达90％的敲除和80％的生存能力。最终，这转化为较大数量的总编辑单元。氙气系统的一个优点是，它允许开发人员微调其产品或过程特定的电穿孔参数。与基于程序的电穿孔系统相反，氙气允许用户调整电压（500-2500 V），脉冲宽度（1-30 ms），脉冲数（1-10）和脉冲间隔（500-1000毫秒）。这样，开发人员可以完全了解应用于细胞的电穿孔脉冲。

ZB：与电穿孔相关的局限性是高压脉冲可能引起的实质细胞损伤。氙气如何应对这些挑战并确保细胞的生存能力？

DK：The ideal electroporation process is one that provides the best balance of transfection efficiency and viability. In general, one comes at the expense of the other as shown by this graph. In this experiment with primary activated T cells, voltage was the most significant variable impacting performance and while increasing voltage increased percent transfection, it also leads to a decrease in viability.

Because the Xenon offers the flexibility for customers to set their own electroporation parameters, it gives them the best opportunity to find optimized conditions that best meet their needs.

ZB：从过程开发到临床制造的缩放细胞疗法工作流程可能是一个挑战。Xenon如何克服这个问题并实现无缝缩放？

DK：开发过程中的关键要求之一是确保电穿孔条件从我们的小规模的霓虹灯转染系统缩放，而无需重新优化氙气。无论我们的客户正在工作多少，都必须实现同等的性能。为了实现这一目标，我们的工程团队对霓虹灯的硬件和消耗品进行了广泛的表征，以了解其功能。他们维持了路径长度（电极之间的距离），这是生成等效波形和脉冲轮廓的关键。它们还表征了电穿孔过程中产生的温度和压力，以了解其如何影响性能。从第一个面包板到最终原型，所有实验均具有霓虹灯控制作为性能基准。

ZB：电穿孔期间和立即通过什么细胞通过？

DK：在有点直线的顶部阴极（+）和底部阳极（ - ）电极之间发出电荷。在电荷撞击细胞的地方，在那里打开了一个临时孔，并且会发生细胞外和细胞内材料的交换。孔的大小和频率取决于细胞膜的组成。例如，很难在刚性区域（例如大脂质的毛孔）中创建毛孔。膜完整性和细胞内材料的丧失是细胞可能无法从中恢复的东西。

ZB：Thermo Fisher是否对各种细胞类型进行了优化的协议，并具有可用的性能数据？

DK：在Xenon系统上，我们通过20-100 m细胞/mL（特别是20 m，50 m，，50 m，50 m，，使用我们的培养物和有效载荷系统，从新鲜和冷冻材料中优化了3天CD3/CD28 Dynabead激活的PBMC和PAN T细胞的电穿孔。＆100 M细胞/mL）。相同的电穿孔程序与其他文化，激活和有效载荷系统良好。因为我们已经证明了霓虹灯转染系统的可伸缩性，所以我们的客户可以在数据库中参考超过140个优化协议。

ZB: What are the key variables from an engineering perspective that affect electroporation performance?

DK：The engineering factors identified to have an impact on biological performance were related to consistent voltage and current being delivered to the electroporation chamber. During a MultiShot run, to ensure consistent performance from shot to shot, it was critical to have equivalent filling of each electroporation as well as to maintain pressure inside the chamber to eliminate the risk of arcing. Temperature is also a key variable. It directly affects the conductivity of the buffer and thereby the energy delivered to the cells, but also cell viability is impacted when a temperature threshold is exceeded. As a result, the system has an internal safeguard to prevent electroporation protocols that would result in unsafe temperatures. Finally, to ensure scalability from the Neon tip, we had to ensure that the distance between the electrodes of a Xenon consumable was the same as that in the Neon tip.

Don Paul Kovarcik正在与技术网络的营销活动协调员Zoe Braybrook交谈。捷克葡萄牙直播