如何选择右Western印迹检测方法
如何选择右Western印迹检测方法
蛋白质印迹是一种分子生物学技术，该技术以基于尺寸的分离和蛋白质检测为中心。它由十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS -PAGE）组成，然后将蛋白质转移到膜上（硝酸纤维素或聚乙烯二氟乙烯 - PVDF）上，并随后检测到蛋白质和二抗抗体。可以找到详细的蛋白质印迹协议这里。
重要的是要了解检测膜上感兴趣的蛋白质的不同方式的优势和缺点。在这里，我们介绍了蛋白质印迹的三种主要蛋白质检测：1）放射性，2）酶促和3）图1中的荧光。
1。放射性检测
要开发的初级抗体检测的第一个方法之一是使用标记为放射性同位素（PMID：388439）。碘125是一个流行的选择，具有相对较长的半衰期和γ射线的发射，由低能光子组成，可以使用X射线膜很容易地检测到。曾经是一种流行的技术，如今的使用相对罕见。
好处：放射性检测具有良好的灵敏度，并且非常可量化。
缺点：
•非常费力的 - 最终用户通常必须用放射性同位素标记。
•挺贵的。
•危险 - 需要特定的辐射安全培训，适当的个人防护设备（PPE），注册表和废物处理系统。
•由于标签的放射性衰减而导致的检测抗体的保质期有限。
建议：不要使用，更多的现代方法更有效 - 见下文。
2。酶检测
蛋白质印迹中最常见的检测方法之一是基于与酶结合的二抗的使用。二抗具有与原代抗体识别的靶蛋白的结合特异性，而附着的酶用于检测。膜与二抗孵育后，将含有特定底物的溶液应用于膜。该酶会催化底物的转化，该底物严格地定位于二抗与之结合的膜的位点。该反应导致在膜上形成不溶性的彩色沉淀物或可以检测和定量的光子释放。这分别是比色和化学发光检测的基础。
一种。比色
比色检测中最常用的两种酶是碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）。将蛋白质印迹膜与与AP或HRP结合的二抗孵育后，将膜与含有酶底物的溶液一起孵育。在AP的情况下，底物是四唑盐盐，可简化为不溶性formazans。HRP的成色底物包括二氨基苯胺（DAB），四甲基苯胺（TMB）和偶氮乙基苯甲酰苯二唑磺胺 - 磺酸（ABTS）盐。蛋白质印迹膜上酶促反应的成色产物可见，并且长期以来稳定。可以量化沉淀的量，并对应于分析的蛋白质的量。
好处：
•便宜且快速。
•生成的彩色产品是稳定的（小时到几天），因此即使在吸毒后几周才能实现成像和定量。
缺点：
•难以量化 - 用户定义了降水反应的持续时间，在大多数情况下，这是不可逆的。有限的线性测定范围。
•敏感性 - 通常需要至少存在分析蛋白的纳米图才能创建可见的带，这不如化学发光和荧光检测方法。
建议：用于抗体筛查和快速评估。
b。化学发光
HRP和AP酶也可以用于适当的底物的化学发光检测中。与AP相比，HRP更常用于AP，这是由于底物的更广泛，并且通过使用基于luminol-或Acridan的化合物获得的灵敏度提高。与比色检测类似，将蛋白质印迹膜与与酶偶联的二抗孵育，然后将含有适当底物的溶液施加在膜上。反应的中间产物会产生低能的光子，可以通过将膜放在X射线膜上或通过电荷耦合器件（CCD）摄像机以数字方式收集来检测到。与比色检测不同，产物并不溶解，也不会在膜上形成可见的沉淀。反应是瞬态的，需要在最初的几分钟到几小时内检测。市售的HRP底物具有极大的敏感性。
好处：
•灵敏度 - 可以通过使用特定的HRP底物检测和量化分析蛋白的feStigitivity。
•定量 - 使用数码相机的使用允许识别过度曝光的膜，以确保在线性检测范围内进行测量。
缺点：
•检测的时间 - 仅在底物转换为产品期间发出光 - 在添加底物后需要立即进行检测。
•缺乏多路复用 - 如果两种检查的蛋白质的大小相似，则可以通过化学发光检测来同时检测两种蛋白质。需要连续检测 - 在与第二个靶蛋白的抗体孵育之前，需要从膜上剥离第一种检测抗体。膜剥离需要额外的时间和控制，以确保膜不会损失蛋白质。
建议：由于样品中分析的蛋白质水平较低，因此需要定量和高灵敏度。
3。荧光检测
在这种方法中，检测抗体不是与酶相结合的，而是与荧光团结合。荧光团受到特定能量的光激发，从而导致光在更长的波长下发射光（例如，激发680 nm，发射694 nm）。与二级抗体孵育后，使用配备雪崩光电二极管（APD）或CCD摄像机孵育后的蛋白质印迹膜，该设备检测到发射光。与酶检测不同，不需要底物来启用检测。使用的荧光团通常位于光谱的极右端（红色和红外线），以最大程度地减少自动荧光。检测需要使用专用设备，能够在选定的光谱处用光照亮膜。光源主要是LED或激光器。过滤组允许特定检测荧光团并最大程度地降低背景。使用多个荧光团具有非重叠发射光谱的使用允许同时检测多种检测抗体，而无需洗涤和重新探测膜。
好处：
•多路复用 - 当检测抗体对与不同的荧光团结合时，可以同时检测两个非常相似的分子量的蛋白。将磷酸化蛋白的丰度与总蛋白水平进行比较时，这特别有用。
•稳定性 - 与检测抗体一起孵育后，可以在室温下存储几个月，并在方便的时间检测到信号。
•易于使用 - 在检测前将膜与辅助抗体一起孵育后，不需要其他步骤。
缺点：
•需要专门的设备进行检测和图像采集。由于标准PVDF膜的自然自动荧光，需要使用特殊的PVDF膜。
•灵敏度 - 低于化学发光检测，但线性范围较宽。
建议：理想的定量和多路复用。
提出的所有检测方法都具有优势，但也有局限性。重要的是要优化Western印迹方案和实验条件，以实现最佳结果。出色的结果需要良好的信噪比，通常可以通过最大程度地减少背景或改善弱/无信号，非特异性带来实现。
