完成下面的表格,我们将电子邮件您的PDF版本“单细胞测序的最新进展和应用”
单细胞测序或单细胞基因组学技术,迅速发展在过去十年中,已经巩固了自己是无处不在的技术利用生物学和生物医学科学研究人员在多个领域。这些技术之前使用排序方法提供显著的优势——称为批量排序——专注于分析的分子特征集合的细胞组织,而不是单个细胞。
自组织和器官是由异质的细胞类型具有独特分子资料,获取单细胞分子配置文件允许正常生理过程的深入了解以及疾病。单细胞基因组显著增加了我们理解的特定类型的细胞分化和成熟在不同器官系统和疾病如何影响特定的细胞类型。“大脑疾病影响的研究尤其是受益于单细胞基因组学技术,”卢卡斯Schirmer指出,海德堡大学的助理教授和多发性硬化症的临床科学家专业。“这是由于巨大的大脑细胞的异质性疾病很难解决使用其他方法”。
近年来,单细胞测序已超出范围最广泛使用的技术,如单细胞RNA序列(scRNA-seq),现在允许分析基因组DNA、蛋白质表达和表观遗传特征在单细胞水平。”这些不同的模式,尤其是表观遗传调控至关重要资料以来癌症肿瘤细胞的上下文中使用各种机制逃避身体防御”妮可·萨拉查Velmeshev博士说,旧金山州立大学助理教授研究癌症基因组学。最近的另一个趋势是同时分析多个分子形式,如RNA和表观基因组,在相同的单个细胞。单细胞基因组学研究的爆炸也离不开技术的发展更快,更敏感,更大规模的分析单个细胞,以及伴随的生物信息学分析技术的发展。在这里,我们审查最常采用技术和工作流用于单细胞测序和讨论当前研究采用这样的方法。
实验工作流单细胞RNA序列
scRNA-seq是应用最广泛的单细胞基因组学技术,旨在获得单个细胞的基因表达谱与感兴趣的一个示例。两细胞的基因表达谱表明身份和其状态,所以scRNA-seq可用于确定被分析细胞的类型以及其基因表达谱(也称为转录组)的变化感兴趣的一个条件——例如,在一个特定的疾病状态。
scRNA-seq的第一步是获取单个细胞进行分子条码的RNA分子源自相同的单个细胞。在过去的10年中,一些细胞捕获方法开发;microwells的主要方法包括捕获细胞微流控设备,单个细胞分类装进井一盘使用fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)或最近,封装单个细胞在水液滴形成的一种亲脂性的媒介。一旦捕捉到单个细胞,逆转录(RT)是用于生成互补DNA(互补)从每个细胞的RNA分子,同时引入一个独特的DNA序列到每个互补脱氧核糖核酸分子(细胞条形码)。在droplet-based scRNA-seq, RT引物与细胞条形码外套一个捕获在一个硅珠滴加上单个细胞,从而确保每一个独特的细胞条形码只局限于RNA包含在一个特定的细胞。除了细胞条形码,RT引物还可以用于包括第二个条形码——一个独特的分子标识符(UMI)——这是独一无二的每个DNA分子的底漆。umi允许量化原始RNA分子的数量,而不是cDNA、优惠,因为互补脱氧核糖核酸复制的数量是受技术因素的影响,如PCR的偏见。互补脱氧核糖核酸然后准备下一代测序(上天)通过破碎,切断测序适配器和放大。通过测序细胞条形码,UMI和相对应的部分cDNA原始RNA分子,可以确定每个个体细胞RNA分子属于其丰度和量化。
为其他单细胞基因组学应用程序工作流
工作流为其他单细胞测序方法,如单细胞表观遗传学分析,通常包括单个细胞的分选板井或一个方法称为组合索引。组合索引使用一组两个条形码,而不是单个细胞条码,标签RNA或DNA来自相同的单个细胞和提供单细胞决议而不需要单个细胞。生物分子被编码后,根据所需的读出他们处理,如转座酶消化开放染色质分析单细胞ATAC测序亚硫酸氢(scATAC-seq)或治疗单细胞DNA甲基化分析。
新方法已经发展到多个分子形式,如开放染色质和RNA表达,在单个细胞。“组合分析尤其吸引我们的癌症生物学家开放的途径研究肿瘤细胞的类型和状态,以及他们的表观遗传状态。一些最有效的癌症治疗是针对调节肿瘤细胞的表观遗传状态,因此了解癌症表观遗传学未来的治疗是非常重要的,”Velmeshev说。
将空间映射和确认签名的单细胞基因RNA序列工作流
复杂的、高度异构组织,如大脑,由多种细胞类型和状态。然而,审讯这些复杂的组织类型需要一个高度敏感的,具体的,与单细胞和多路复用空间的方法解决。下载这个程序注意发现技术上升到这些挑战,使研究人员能够同时检测12 RNA的目标。以及空间地图scRNA-seq基因档案在单细胞水平的组织环境和本地化新发现细胞亚型和细胞标记。
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生物信息学分析单细胞测序数据
一旦scRNA-seq数据生成,几个选项可用于下游的生物信息学分析。首先,原始测序读需要对齐参考基因组,细胞需要检测并读取条形码(或umi)源自相同的细胞的RNA需要分配给基因和量化。本节scRNA-seq分析计算资源密集型和通常是高性能计算集群上执行。一些免费的生物信息学管道,如dropSeqPipe,存在产生的原始数据进行分析使用Drop-seq和plate-based scRNA-seq方法。
原始scRNA-seq数据分析的最终结果是一个矩阵的读或UMI每个基因计数为每个细胞捕获和分析。这个矩阵的输入下游分析工具旨在识别特定的细胞类型中包含原始样本,他们的基因表达标记,以及转录组细胞在实验条件的变化。最无所不在地工具用于下游修单细胞基因组数据分析软件包1和单片眼镜2。修可以用来执行公正的单细胞基因组数据的聚类,组织细胞基于单细胞分子概要文件是多么相似。修也可以用来识别的标记产生的集群(通常对应于细胞类型),除了集成来自不同来源的数据集和方法(如scRNA-seq和scATAC-seq)。单片眼镜是用来执行所谓的拟时间分析,安排单细胞概要文件根据基因表达的动态变化或其他形式,如ATAC-seq信号。拟时间分析有助于发现特定细胞类型的变化发生在一段时间内或作为一个持续的过程的结果,如大脑发育或神经变性。重要的是,这两个软件包可以应用于不同形式的数据和不限于scRNA-seq单细胞测序。
利用scRNA-seq大规模基因组学研究
scRNA-seq已经应用到许多生物的问题;然而,这项技术尤其在神经科学领域成功地解决问题。这是由于这样的事实:哺乳动物,特别是人类的大脑是最复杂的器官包括成千成百上千的不同的细胞类型。与细胞在免疫系统等其他器官,大脑细胞很难隔离使用流式细胞仪等传统技术。
scRNA-seq被用来创建一个单细胞分子图谱的发展人类的大脑,这创造了一个人类大脑发展的蓝图,是至关重要的对于理解神经系统疾病的发展。在一系列引人注目的研究中,修改scRNA-seq称为single-nucleus RNA序列(snRNA-seq)已经被应用于事后大脑组织样本来研究分子变化的特定类型的细胞在神经发育和神经退行性疾病,如自闭症谱系障碍3、多发性硬化症4(女士)和阿尔茨海默氏症5。Schirmer,第一作者snRNA-seq女士的研究中,指出:“Single-nucleus RNA-seq真的是大开眼界,我们关于病理女士。五年前,我们只能学习一些基因的表达在有限数量的细胞类型。现在,使用相同的组织,我们可以知道每一个基因的改变在每个细胞类型的女士病变进展。”
最新研究,利用单细胞表观遗传学分析
单细胞表观遗传分析正迅速成为有助于揭示如何在组织和特定细胞类型的起源发展和受到疾病的影响。因此,scATAC-seq最近被用于研究细胞的表观遗传特征在发展中人类大脑6改变分化和成熟。此外,scATAC-seq被用来洞察表观遗传调控的作用在各种癌症的进展,如三阴性乳腺癌7。Velmeshev表示:“这些新方法,包括单细胞ATAC测序和DNA甲基化,将允许我们看特定的肿瘤细胞克隆改变他们的表观遗传概要文件和如何纠正这些变化由表观遗传药物”。
近年来,单细胞测序已经成为选择的方法在许多领域的生物医学研究由于其能够提供的所有细胞类型的分子状态信息和成千上万的单个细胞样本。这些技术发展迅速提高他们的敏感性和可伸缩性和降低价格,所需的时间和资源进行单细胞测序研究。
引用:
2。曹J Spielmann M,秋X et al。哺乳动物器官形成的单细胞转录景观。自然。2019,566 (7745):496 - 502。doi:10.1038 / s41586 - 019 - 0969 - x
* *本文基于研究成果
尚未同行评议。因此被视为初步结果
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