流式细胞术近几十年来转化了临床免疫诊断景观。¹这种复杂和强大的技术使用荧光团标记的抗体对各种生物标志物的荧光标记细胞，然后分析以在单细胞分辨率下揭示细胞群内的生物标志物的分布模式。²临床流式细胞术的一个常见应用用于免疫蛋白酶型，其鉴定免疫细胞，以帮助诊断血液学恶性肿瘤，尤其是白血病和淋巴瘤。^3-5它还用于量化DNA细胞含量，⁶与儿童淋巴细胞白血病一样，^7,8与患者结果相关联。另外，它可用于分析治疗和检测后处理后残留的恶性细胞。^9.

免疫疾病治疗是流式细胞术的另一种临床应用，其中用于鉴定艾滋病毒感染后的CD4 +和CD8 + T细胞亚群^10.或诊断原发性免疫缺陷。^11.它可以揭示同种异体骨髓或造血干细胞移植后某些免疫细胞亚群的存在。^12,13.临床流式细胞术的新兴应用是使用荧光激活细胞分选（FACS）来收集满足某些表型标准的分析后的细胞，隔离干细胞以进行移植或基于细胞的疗法。¹

临床流式细胞术应用于经过验证的方案进行，经过仔细设计，以考虑最佳荧光团组合以最小化光谱重叠和足够的生物标志物以识别感兴趣的人群。此外，含有荧光团亮度之间的稀有细胞群之间的平衡确保了感兴趣的群体将是可辨别的。流式细胞术具有若干优点，例如：（i）单细胞分辨率能力，使得能够在异质群体内鉴定稀有细胞群，这可能具有重要的疾病诊断后果，2（ii）多路复用，同时检测几种生物标志物，^14.（iii）复杂但坚固的仪器和软件处理包，可实现一致的性能和易于数据分析，（iv）快速样品处理，以便更快地通知治疗课程。

校准是关键的

在优异的工作状态下维持流式细胞仪非常重要。这意味着需要每日仪器校准和标准化，以确保从不同日内收集的数据之间的一致性并验证机器处于工作状态。^2,15.这可以通过运行校准检查对抗参考珠粒，根据制造商的说明，在窄的公差限制内小心地在窄的公差限制内进行仔细制备，这是将采用的所有颜色。该过程测试仪器的灵敏度和线性度，并确保珠子的平均荧光强度落在仪器中各激光器的正确目标范围内。该方法在大多数现代流式细胞仪中自动化，仪器产生所有测试参数的读数。

颜色补偿

与流式细胞术中使用的抗体缀合的荧光团具有相对宽的激发和发射曲线（图1）。这导致荧光团之间的“交叉谈话”，其中激光激发旨在激发特定荧光团“a”，无意中导致在通道中为“b”的一些信号。²颜色补偿是消除或最小化该串扰的过程，并且应该用与每个荧光团缀合的珠子进行，测定将根据制造商的指示使用加负控制。

图1。荧光素异硫氰酸酯（FITC）和Phycoerythrin（PE）发射曲线之间的光谱重叠之间的插图。用于激发FITC的488nm激光器导致FITC发射，该发射溢出到带通（BP）滤波器范围（由蓝箭头表示）的PE，有助于在PE通道中的信号。

考虑控制

珠子的光学参数与免疫细胞的光学参数不同。因此，一旦执行QC，希望使用从前一次运行的前一次运行测定特异性控制。在该阶段，可以对前向散射（FSC）和侧散射（SSC）的光电倍增管电压（PMTV）进行调整，以使淋巴细胞呈规模。接下来，应该使用以下方法进行对照：（i）未染色的阴性细胞，其应低于先前建立的阳性细胞的阳性细胞在所有荧光通道中的阳性细胞，（ii）测定中使用的每种荧光团的阳性对照，这应该落入尺寸高于阈值，（III）异型抗体对照，其应低于阈值。可以应用对每个荧光团的PMTV的调整，以优化负面控制的放置。

样品加入和处理

正确的样本处理需要将样本正确记录到实验室的信息系统中，注意到使用哪种抗凝血剂，因为它可能影响流动分析，并选择莱斯红细胞的方法。²活死染料对于从死亡中辨别出活细胞的重要性，从而将分析限制为活细胞并从分析中排除死细胞，这可能是自欺欺人和引起背景噪声。¹⁵如果仅用于细胞表面受体的染色，可以使用新鲜细胞，并且可以使用膜完整性染料来区分死亡的活细胞。²如果还针对细胞内蛋白染色，需要在固定和透化细胞内染色之前进行表面受体的染色。另外，由于固定过程透露细胞，因此将需要固定活力染料的预处理，因此固定过程透露细胞，因此排除了膜完整性染料的使用。¹⁶

一致性是钥匙

流式细胞术是一种敏感的技术，并且为了获得实验的实验可再现结果是极限变化，即使在细胞器实验参数中，例如，温度细胞保持在，抗体染色程序和抗体缀合的荧光团的照射。

试剂验证

尽管试剂准备到严格的标准，但仍然可以发生批量批量变化。另外，储存条件和运输和处理程序可能影响敏感试剂，例如抗体。为了确保试剂表现得预期，可通过以下方式进行试剂验证：（i）通过与参考资料进行直接分析，（ii）对新试剂的平行试验，例如在打开新试剂瓶/管时重叠测试，（iii）与对照进行比较，例如通过使用商业QC细胞样本。²新批次的抗体浓度可以通过抗体滴定到细胞中验证，例如淋巴细胞，以确认在测定中使用的抗体浓度。此外，良好的记录保存，例如注册到期日期和批号，也可以帮助减轻通过存储和时间引起的试剂的变化。

数据分析

有许多方法可以进行流式细胞仪收集的数据和几种格式，以显示数据。仔细考虑数据完整性以及需要完成特定分析方法的基本原理，以确保其满足临床测试的需求。一旦建立了一种数据分析方法，就可以以相同类型的临床流动试验分析结果，例如，对前体B细胞淋巴细胞白血病免疫蛋白酶型以相同的方式分析结果，以获得一致的结果。这包括：（i）门控程序，确定分析首先考虑哪个荧光通道的过程，²（ii）正确标记群体（例如，哪种细胞是前体B细胞），（iii）将群体注释为总事件的百分比或其从（IV）类型的群体的百分比用于绘制结果，例如对数与双指数（Hyperlog或“Logicle”）的规模。^2,15,17,18

感知模式

重要的是擅长认识到健康样本中细胞群分布的模式，以便患有疾病患者的样本可辨别并脱颖而出。熟悉细胞的预期模式分布也有助于感知仪器内发生问题，因为它在当天早些时候的校准和标准化，例如由碎片引起的流动细胞内的湍流，这可能会影响结果。

保护患者身份

由于患者隐私，确保样本和数据是保密和安全的很重要。密码保护和加密措施可以促进此功能。此外，数据完整性和备份以防止数据丢失也是必不可少的保障。记录保存记数更新的流式细胞计可以在校准后存储QC报告，使QC历史可直接访问，以便随着时间的推移观察趋势。或者，可以利用Levey-Jennings Plots来分析QC数据的演变。²持续落在范围之外或始终如一地上或低于平均值的QC值可以指示仪器故障或漂移。

免责声明：我们不是以任何方式指示如何进行临床流程，而是仅提供教育指南。

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