转染是一种必不可少的细胞生物学技术，通过它可以将核酸（DNA和RNA）引入真核细胞中。当一个人想要在细胞中表达基因工程蛋白（通常是通过质粒DNA转染）或耗尽内源性蛋白（通过siRNA转染）时，这一点特别有用。

从广义上讲，通常使用了三种转染方法：化学转染，电穿孔（或核反射）和倾斜/逆转录病毒转染。前两种方法被认为是“瞬态转染”，因为由于降解和稀释，细胞中引入的核酸的量会随着时间的推移而降低。另一方面，病毒转染将DNA掺入内源性染色体中，该染色体在整个细胞周期中复制，因此被认为是“稳定转染”。在本指南中，我只专注于瞬态转染方法，因为我的经验比病毒转染更棘手。

有许多用于化学转染和电穿孔的商业套件。无论您是遵循制造商的协议还是纸张的协议，您通常都会发现很难在不优化需求方案的情况下获得令人满意的结果。以下是我认为是成功转染的最有用技巧的列表，这些技巧是通过多年的经验和故障排除转染实验来学习的。

化学转染与电穿孔

化学转染有许多优势。首先，它不需要设备和卧铺。考虑到一个非常基本的电穿孔设备约为1​​0,000美元，这可能是一个巨大的优势。其次，转染所需的细胞数量具有更大的灵活性。使用电穿孔，所使用的细胞数很大程度上取决于比色杯的大小。

在哪种情况下，为什么要使用电穿孔？首先，电穿孔适用于某些细胞类型，这些细胞类型难以通过化学转染（例如某些主要细胞系）转染。其次，我认为该协议更简单，因为在分裂细胞培养时可以执行电穿孔。

一些其他提示：

• 大多数商业化学转染试剂盒都是为DNA转染或siRNA转染而设计的，但是我看到许多人说可以将任何套件用于两种应用。
• 大多数公司提供免费样品，您可以使用这些样品。
• 电穿孔装置也可用于将其他膜侵入分子传递到细胞中（例如Alexa染料）。

进行优化

首先，尝试制造商的协议。一些制造商还提供特定于细胞类型的协议，因此请检查其网站。如果您最终看到毁灭性的细胞死亡（经常发生）或转染效率非常低，则应优化。如果您要进行化学转染，不同的DNA量，DNA与反应的比率，转染时间和生长培养基中血清和抗生素的存在（除非该方案说这真的没关系）。在我看来，最重要的因素是DNA和试剂的量。当我使用的DNA和试剂少于制造商协议中建议的数量时，我总是得到更好的结果。如果使用电穿孔，则可以尝试不同量的DNA，电压和脉冲持续时间。

进行验证

您可以使用RT-PCR，Western印迹，FACS或成像来评估转染效率。我最喜欢的验证方法是用GFP质粒或荧光控制siRNA转染，并通过使用具有10倍物镜的简单荧光显微镜来量化显示荧光信号的细胞的分数。

使用高质量的DNA

从中提取的质粒e.coli培养物可能会受到内毒素的污染，内毒素在转染实验中对细胞活力有害。我强烈建议使用中级或最大规模的DNA提取试剂盒（而不是微型级），该试剂盒涉及更广泛的洗涤步骤和乙醇沉淀步骤。

使用健康的细胞。细胞的生存力和健康也是影响细胞转染效率和转染后生存能力的重要因素。

• 限制通道号；我通常不维持超过2个月的细胞培养。
• 给细胞足够的时间从应力中恢复。在解冻新的冷冻库存后，我建议在使用前几次传送单元。我还将确保在使用化学转染之前分裂后至少生长过夜。
• 谨慎污染，尤其是如果您在增长培养基中不使用任何抗生素，因为它会影响转染效率。Do mycoplasma test regularly (it’s very simple to perform), and if you get a positive on the test, or see small objects (a few micrometers) floating around under the microscope, don’t hesitate to throw away your culture and thaw a fresh vial of frozen stocks, and replace your media, PBS, and trypsin.
• 不要让您的细胞培养过度融合。在细胞达到〜90％汇合之前，将其传递。

做控制实验

这适用于任何生物学实验，但对于siRNA转染实验尤其重要。用对照siRNA（不会耗尽任何蛋白质的siRNA）进行转染以评估转染的毒性或任何副作用。

希望您发现这些技巧有用。如果您仍然对转染结果不满意，请考虑使用病毒转染，用诱导型或较弱的启动子代替质粒中的启动子（以减少过表达引起的毒性），或者如果可能的话，请切换到其他细胞类型。