ELISA以其简单性，特异性和成本效益而受到青睐，是全球许多实验室中使用的一种有用的技术。可以在商业上购买广泛分析物的ELISA套件，尽管这些套件往往很昂贵，而且钱通常很紧，尤其是在研究环境中。这导致许多实验室开发自己的分析，尤其是在预算工作或需要分析许多样本的地方。尽管整个技术都易于使用，但仍有许多因素需要考虑使用强大而可靠的测定法。以下是我在此过程中经历的一些东西，并希望分享，以节省您的时间，压力和金钱，并帮助您取得最佳效果！

1.明智地选择表面

由于ELISA中用于涂层的蛋白质的多样性，因此有多种具有多种结合特性和能力的专业曲板。在开发新测定时，应评估一系列表面，以确定哪种表面对于要测试的抗体/抗原是最佳的。大多数板由相同类型的塑料制成，例如聚氨酯或聚氯乙烯，但它们是由不同的结合特性制成的。至少要尝试使用具有低，中和高约束能力的几种塑料。选择塑料时，成本也是一个重要的考虑因素，尤其是在测试大量样品的情况下。此外，用于涂覆板的分子应适当滴定，以确定在测定中使用的最佳浓度。

2. Chequerboard

虽然在测定中使用高浓度的抗体似乎是明智的，尤其是在样品中检测到的分子不是很丰富时，这可能是违反直觉的。正确滴定在测定中使用的所有抗体以及样品，可确保信号与噪声比是最佳的。目的是具有最低的背景，具有最高的光密度（OD），以进行精心设计和敏感的测定。在使用过多抗体的地方，由于未特异性的结合，背景噪声将很高。如果浓度太低，则测定将失去灵敏度。测试此目的的一种有效方法是进行一系列用于涂层，样品和二抗的分子的连续稀释液（加上任何其他抗体，例如设计三明治ELISA时）并对每种抗体进行测试其他，每个条件都具有负面控制。这允许在几个简单的实验中确定每个的最佳浓度。也可以同时分析多种类型的塑料。

3.正确样品稀释是关键

在调查测定方法以变异性时，通常会忽略样品的适当稀释。如果需要在使用之前将样品稀释（例如使用血清时），则逐步稀释是至少移动误差的关键。例如，如果Chequerboard实验已确定应在添加板之前将血清1：100稀释，则明智的做法是对样品进行1:10稀释，然后进行后续1:10稀释。尽管这似乎很明显，但通常没有进行，并且可以在实验之间产生巨大的差异，这对研究人员来说是令人沮丧的，并且可以非常简单地避免，从而提高了测定的可靠性。在比较同一实验中的样品时，稀释不当也会产生误导性结果。例如，如果比较了两个血清样品以确定是否发生了血清转化，则不当稀释的样品可能意味着如果由于稀释技术较差而添加了过多的转化前样品，则错过了血清转化。

4.所有抗体均不相等地创建

虽然可能并非总是可能的，而有多种可利用感兴趣蛋白质的抗体，但最好测试每种抗体。选择抗体时有很多考虑。多克隆抗体具有更大的靶范围，通常更便宜，但可能会降低测定的特异性。单克隆抗体通常更昂贵，但如果抗体使用的表位在感兴趣的抗原上可见（但如果不是，则可能根本不结合）。通常，测试此目的的唯一方法是尝试各种制造商的一系列抗体。值得庆幸的是，许多制造商为此目的提供了少量样本量，或者愿意提供这些样本量。When selecting pairs to use in sandwich ELISAs, this choice becomes even more important, as the antibodies must recognize different epitopes to each other.

5.当心阻止惊喜

Many investigators trial a range of blocking agents during the development stages of an assay and make the choice to use that which gives the best signal to noise ratio. A factor which is often under considered when making this choice is batch to batch variation of particular blockers. Blockers are often biological agents, such as bovine serum albumin (BSA). BSA is a very effective blocker in a broad range of assays, but due to the nature of the reagent it can vary hugely between batches, with some batches containing large amounts of cross-reactive antibodies that will interfere with an experiment, and some lots containing little to none. Therefore, if a blocker such as BSA or foetal calf serum is chosen it is prudent to test several batches to check for consistency in your results before committing to a given one. This is an important consideration, and for unlucky individuals can often be the cause of many failed experiments once the batch tested initially has been used up! Where batch to batch variation is seen, but blocker choice cannot be modified, often manufacturers are happy to hold particular batches aside if they are consulted and have an idea of how much will be used.

6. Batch testing of secondary antibodies

与阻塞剂类似，二抗批次也可能有所不同。尽管他们的整体活动可能不会改变，但所需的数量可能会有所不同。当在另一种二级抗体中购买时，值得与以前的批次进行简单的实验，以确保所使用的浓度仍然合适。可以使用相同稀释的假设有时意味着当批次更改时，背景噪声突然变得更高，这可能是令人讨厌的惊喜！

7.不要忘记正常化！

通常被忽视的是，归一化会在板/实验之间进行任何变化，并最大程度地减少其对整体结果的影响。在将血清用作分析物的实验之间归一化的一种简单方法是将每个血清样品的结果与负血清对照的结果进行比较。通过这样做，从室温和开发时间等外部因素的任何变化都可以最小化。通过将测试样品的OD除以对照的OD，结果可以表示为折叠变化。尽管这不是绝对的量化，但通常不需要绝对数字，但是仍然可以获得一组健壮的结果，可以将样本相互比较。

8.知道您的动态范围

在设计一个实验时，使用标准曲线来确定样品的浓度时，重要的是要保持在读取板的动态范围内。这些值将在制造商手册中指定；许多机器的上限为〜1.5 OD。准备标准曲线时，最高标准（即最集中的）必须低于动态范围的最高OD。通过使用位于此范围以上的标准，针对标准曲线的结果外推变得风险，因为该数字高于此数字的任何OD可能不准确，许多较新的板读取器模型都可以调整动态范围，但是如果您使用的是模型这是不可能的，需要在标准曲线设计中考虑最大OD。所有样品也必须落在该动态范围内，才能准确测量并确定浓度，因此也必须考虑样品稀释。最初这可能会令人沮丧，但是一旦操作员感觉到一批样品中的浓度范围，就可以使用对样品的标准稀释，使其适合此范围内，并为将来的实验带来良好的结果。