CRISPR-CAS9是一种革命性的基因组和表观基因组编辑资源，它迅速流离了旧的基因组编辑工具。因为这是一项新技术，所以许多科学家和研究人员都不了解其许多复杂性。而且，要提高他们对这款新型工具的了解，该工具正在从实验室到实验室。如果您适合该类别，或者只是想学习一些技巧和技巧以优化基于CRISPR的实验，那么本指南适合您。

细胞不喜欢双链休息 - 根本不喜欢

简而言之，CRISPR-CAS9 DNA编辑产生的DNA双链断裂（DSB），其由RNA分子引导，该RNA分子与其基因组靶标互补。但是，DSB非常细胞毒性，如果不修复，可能会导致细胞死亡。细胞通过两种通用方式进行了DSB的修复：通过非同源末端连接（NHEJ）或通过同源指导的修复（HDR）。^1，2当DSB的两个裂解末端被束缚在一起时，就会发生NHEJ，通常会导致在DNA的两个链上随机插入或缺失（indels）。因此，很难预测所得NHEJ修复的确切序列。相反，HDR是一种较少的随机修复机制，在该机制中，将其他染色体上的DSB同源区域用作修复模板。所得序列将是其他染色体的确切序列。在细胞中，两种机制均用于确保基因组完整性，但是CRISPR-CAS9使用这些方法来生成感兴趣的基因编辑。¹

CAS9编辑的RNA组件

CAS9需要两个RNA分量才能正常运行：3'端（tracrrna）上的结构成分，以及将CAS9裂解引导到其基因组靶标（CRRNA）的第二个成分，位于5'端。这些可以组合形成嵌合单引物RNA（SGRNA）。^1、2、3本节将重点介绍CRRNA的设计或指导Cas9裂解的SGRNA的一部分。

通常，CRRNA的至少20个核苷酸必须与目标链3'末端的强制性ngg brotospacer相邻基序（PAM）序列互补（这也是CRRNA的3'端）。CRRNA应与目标序列互补。然而，互补CRRNA和靶DNA之间存在一定程度的耐受性。^2,3实际上，CRRNA可以与3或4个基本不匹配的目标位点结合，尤其是在远离PAM的序列中。重要的是，NGG不是20-核苷酸同源性的一部分。目标区域应包含50％的GC含量，因为GC含量过高或较差的GC含量可能会破坏CRRNA的靶向。3GRNA与目标序列结合，将在PAM的第三和第四个核苷酸之间产生A DSB（即底部17和底部。18 of the 20-base target sequence from 5’ to 3’ orientation).^2，3从这里开始，CRISPR-CAS9裂解事件已经进行，该单元将尝试使用NHEJ或HDR修复途径来修复DSB。

基因淘汰和删除

敲除可以说是使用CRISPR-CAS9生成的最简单基因编辑。只需生成grna，添加cas9并切割！但是，在表征敲除时，请确保所得的Indel不在3个中，因为这被认为是“框架”删除或插入，并且基因仍可以正常运行。

由于CRISPR-CAS9编辑的强大性质，可以轻松生成删除。CAS9只能结合一个GRNA，但是不同的CAS9分子可以结合不同的GRNA并靶向不同的序列。因此，可以在CRISPR-CAS9实验中轻松形成删除。简单地从所需的删除中产生上游和下游的GRNA，并将两者都包括在实验中。使用此策略，基因反转和染色体迁移也可以。

产生单核苷酸多态性

为了生成这些类型的编辑，我们利用了细胞的先天HDR机制。该过程涉及带有带有供体DNA模板的GRNA的CAS9蛋白。当产生SNP或条件等位基因时，单链DNA寡核可以作为DNA模板供体而足以作为DNA模板供体。为了指导正确的DNA修复，DNA寡核管应包括50-80bp的同源臂。²标准ssDNA合成的典型最大长度为200bp，但是如果需要较大的敲入，则有些公司可以产生高达1.5kb的ssDNA。理想情况下，切割位点（从PAM到第三和第四个底座之间）是所需的SNP的位置，但如果没有，则切割位点应距离基地不超过10bp。在供体DNA模板中，包括一定程度的方差以防止CAS9切割先前编辑的DNA非常重要，因为只要GRNA可以识别互补的DNA，CAS9就会继续产生双链断裂。^2，3因此，重要的是要尝试将所需的SNP尽可能靠近PAM，1）破坏PAM周围的基础，以防止GRNA退火和启用Cas9裂解，并2）最大化所需编辑的同源性臂。

大型结构敲击

对于较大的编辑，例如在特定基因座处的基因插入或盒式插入，质粒DNA可以用作供体模板。在这种情况下，同源臂的长度应至少为800bp，并且可能高达2KB。线性双链DNA（例如PCR片段）也可以用作修复模板，但是您应该记住，线性片段可以随机地整合到某些生物体中的基因组中。使用CRISPR-CAS9编辑的大敲门效率极低。在这些情况下，具有较大样本量可能是有用的，因为只有一个或两个单元可能会导致所需的敲入。同样，必须删除敲入构建体中潜在的CAS9切割位点，因为只要目标序列保留，GRNA-CAS9复合物就会继续产生DSB。对于较大的敲入盒式磁带，包括抗生素耐药性标记，荧光标记物或其他一些基因标记物可能会很有用，以鉴定可能将该构建体整合到其基因组中的细胞。

CRISPR编辑可以一次生成多个编辑

所有CRISPR-CAS9事件的基本机制是，它在RNA分子引导下将DNA切割在位点上，然后使用天然细胞机械来生成感兴趣的编辑。在一个CRISPR实验中，有可能在基因中创建一系列有用的编辑。例如，在一个细胞或胚胎中，CAS9 DSB通过NHEJ进行修复，产生可能导致基因敲除的indels。而在另一个单元中，可以使用DNA供体作为修复模板通过HDR修复DSB，从而导致SNP以感兴趣的基因。在某些情况下，可以在两种染色体得到相同的敲入或基因破坏的情况下生成双重编辑，尽管这些实例很少。

在开始之前有基因分型策略

信不信由你，生成CRISPR编辑活动非常容易。另一方面，弄清楚所得的基因型可能会更加富有劳动力密集型。这是一些基因分型标准方法的快速概述：

1. PCR检测：该方法依赖于从样品的基因组DNA中扩增基因片段，并且可以轻松地用于检测缺失或插入。
2. Sanger测序：为了确定精确的序列，可以将PCR片段测序或克隆到质粒中，然后测序。Sanger测序的不利之处是，原始PCR产物是，一旦测序迹线达到切割位点，就无法获得太多数据，因为有可能从两个染色体中生成不同的读取。为了辨别精确的序列，需要克隆，这是极限强度的，如果筛选许多样品，则可能不合适，因为每个菌落只能克隆一个染色体的一个遗传片段。
3. Illumina下一代测序：该方法类似于Sanger测序，但提供了更高的吞吐量，因为可以在最小的劳动力的情况下生成数千种单独的读取片段。这也否定了克隆的需求，因为每个单独的读取都会汇总以提供每个提交的样本的大型数据集。这种方法的一个问题是，只有小于400bp的短片段才能可靠地测序，并且只要您仅描述少数样品，就可能不是一种经济有效的方法。
4. PCR产品的限制消化：一旦表征了indel，也可以使用它，或者使用HDR在SNP中包含唯一的限制位点。只需扩大纯化的基因组DNA的片段，并添加限制酶即可。确保检查PCR缓冲液中限制酶的活性，以避免PCR纯化步骤。
5. 表型选择：这可以是抗生素耐药性标记，产生荧光蛋白，也可以是向细胞引入非本质基因。这些是检测您感兴趣的基因的最简单方法，但迄今为止效率最低。仅在引入大型敲入或基因盒时才能使用这种选择。

脱离目标效果

CRISPR不是一个完美的基因组编辑工具。如前所述，CRRNA的结合和基因组靶序列可能会有变化，从而使CRRNA可以退火为Offtarget序列并生成DSB。但是，已经取得了进步，以减轻CRISPR-CAS9编辑活动可能引起的脱靶效应。首先，基因组测序库和在线工具可以帮助设计脱离靶向位点的GRNA，这些GRNA在您尝试编辑的任何基因组中都会减少脱离目标。我经常使用的GRNA设计工具是Crispor服务器（http：//crispor。tefor.net/），它评估目标活动以及潜在的脱离目标。另外，CCTOP服务器（https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/is）有用，可用于确定target网站，而Casoffinder服务器（http://www.rgenome.net/casoftind/casoffinder/）擅长寻找潜在的关闭目标。大多数模型生物的基因组完全测序，因此很容易简化GRNA的发育，以找到潜在的脱靶基因座。随着脱靶分析变得更加主流，我们对选择哪些GRNA的理解变得更加清晰。

减少脱靶效应的另一种方法是修改Cas9蛋白，以减少切割。已经开发了两种主要变体Cas9，其中蛋白质的DNA结合能力大大降低了。2这里的逻辑是，如果Cas9蛋白无法物理与DNA结合，则脱靶编辑将较小，而脱靶编辑将较少。是真的。这些修改后的CAS9的回报是，CRRNA不再与目标序列有任何不匹配。Cas9变体具有降低的DNA结合，可以以Cas9-HF1，ECAS9和Alt-R Cas9的名称购买。

Cas9的最终变体降低了脱靶效应，这是仅刻入DNA而不是产生DSB的变体。²划分DNA可防止NHEJ发生，并产生可以使用HDR修复的断裂。这为在Nick站点提供供体DNA模板提供了机会窗口，以将关注的编辑整合到基因组中。由于未产生DSB，并且通过修复划痕可以最大程度地减少刻度cas9的脱离目标效应，因此几乎完全缓解了dsb。然而，基因敲除的刻度cas9s和通过HDR的维修要稀有得多，因为该细胞在DNA中修复刻度要比投资HDR的能量要容易得多。

现代CRISPR改编

许多小组正在利用CAS9（DCAS9）的催化死亡形式来生成表观遗传编辑。^1，4CRISPR-CAS9的原理保持不变：使用GRNA靶向基因组上的特定区域，唯一的变体是CAS9的活性残基（天冬氨酸和组氨酸）用丙氨酸代替，使其催化活性。当转录激活因子或阻遏物与之融合时，组已使用DCAS9调节基因表达。⁴DCAS9也已用于在组蛋白修饰或DNA甲基化方面进行表观遗传修饰。⁴胞苷脱氨酶也可以与DCAS9融合，以在不产生DSB的情况下生成特定的基础替代。绿色荧光蛋白可以融合到DCAS9上，以跟踪和图像染色体上的特定位点。最后，除了产生交错末端，还有一些同源蛋白到Cas9，例如CPF1（CAS12A），它们也可以在基因组DNA中产生DSB。CPF1还识别了不同的PAM序列NTTT，该序列扩大了基因组中的编辑功能。⁵此外，CAS13可以编辑RNA，而不是DNA，这对于进一步的治疗发育可能有益，因为没有对DNA进行编辑。⁶

参考

1. Doudna，J。A.和Charpentier，E。（2014）。具有CRISPR-CAS9的基因组工程的新领域。科学。doi：10.1126/science.1258096
2. Wang，W.，La Russa，M。，＆Qi，L。S.（2016）。CRISPR/CAS9在基因组编辑及其他地区。生物化学年度审查。doi：10.1146/annurev-biochem-060815-014607
3. Wiles，M。V.，Win，W.，Cheng，A。W.，＆Wang，H。（2018）。CRISPR – CAS9介导的基因组编辑和指导RNA设计。哺乳动物基因组。doi：10.1007/s00335-015-9565-Z
4. Dominguez，A。A.，Lim，W。A.，Qi，L。S.（2016）。除编辑外：重新利用CRISPR-CAS9进行精确的基因组调节和询问。自然评论分子细胞生物学。doi：10.1038/nrm.2015.2
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6. Cox，D.B.，Gootenberg，J.S.，Abudayyeh，O.O。，Franklin，B.，Kellner，M.J.，Jung，J。，＆Zhang，＆Zhang，F。（2017）。用CRISPR-CAS13编辑RNA。科学。doi：10.1126/science.aaq0180