细胞和基因疗法有望在现代医学的格局产生重大影响,携带不同的疾病的潜在治疗数组与未满足临床需要。

然而,批准的数量,临床上采用细胞和基因治疗是纯粹的数量相比目前在开发。翻译的主要障碍的治疗是治疗基因的安全集成到人类基因组。治疗基因的插入熊的“目标”效应的风险,或集成的基因为一个意想不到的位置。

一个许多不同的策略提出了减轻这种影响。最近的作品来自合作哈佛大学生物工程研究所,哈佛医学院(HMS)和在瑞士苏黎世联邦理工学院。

发表在细胞报告方法,研究集中在识别基因组中“安全的地方”。这些地点,称为基因安全港口(谷胱甘肽)的基因组区域符合下列标准:他们可以轻松地访问基因编辑策略,在安全距离内基因具有使治疗基因的表达和功能性质的甲壳低聚糖,只有一次在港“着陆”。一个简单的类比是决定哪些港口停靠一艘船需要考虑的因素有很多,这些取决于类型的船航行,天气条件和易于访问。

研究小组采用的计算策略,使得2000年预测谷胱甘肽的识别。从最初的识别,他们成功的两个网站都进行验证在体外和在活的有机体内通过记者的蛋白质。

捷克葡萄牙直播采访了该研究的第一作者,Erik Aznauryan博士实验室的研究员教授乔治教堂哈佛大学医学院。Aznauryan进一步深入细节的历史谷胱甘肽的研究,采用的方法验证谷胱甘肽站点和本研究的应用前景。

莫莉·坎贝尔(MC):你能谈谈基因组安全港的历史研究,以及他们如何被发现?

Erik Aznauryan (EA):三个基因组网站经验中确定先前的研究支持在人类细胞中稳定表达的基因利益:AAVS1,CCR5和hRosa26。建立了所有这些例子没有任何先天的基因位点的安全评估它们驻留在。

已经尝试识别人类的谷胱甘肽的网站可以满足各种安全标准,从而避免现有网站的缺点。Sadelain开发的一种方法和他的同事使用慢病毒转导β球蛋白和绿色荧光蛋白基因的诱导多能干细胞(万能),紧随其后的是集成的评估网站的线性距离不同的基因组中编码和监管元素,比如癌症基因,microrna和ultraconserved区域。

他们发现一个慢病毒整合位点,满足所有的标准,展示可持续表达万能红细胞分化。然而,全球转录组配置文件改变细胞的转基因整合到这个网站没有评估。维斯和他的同事使用慢病毒类似的方法集成在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞识别网站支持长期蛋白质表达为生物技术的应用程序(例如,重组单克隆抗体生产)。尽管本研究评价了多个网站的耐用,高层转基因在CHO细胞表达,没有对人类基因组的网站进行了推断。

另一项研究,旨在确定谷胱甘肽通过生物信息学mCreI网站的搜索区域的目标monomerized版本I-CreI归巢核酸内切酶的发现和特点在绿藻能够做出有针对性的交错双链DNA断裂——居住在位点满足谷胱甘肽标准。像以前的工作,一些稳定表达的网站被识别并提出了合成生物学应用于人类。然而,本地和全球基因表达分析在这些网站集成事件后尚未进行。

所有这些潜在的谷胱甘肽网站拥有一个共同的局限性被慢病毒,或者缩小mCreI-based集成机制。此外,这些识别网站的安全评估,以及先前建立AAVS1,CCR5和Rosa26,是由评估差异基因表达的基因位于附近的仅仅这些集成网站,没有观察全球转录组变化后集成。

谷胱甘肽的更全面的bioinformatic-guided和全基因组搜索网站基于建立的标准,其次是实验评估转基因表达的耐用性在不同的细胞类型和安全评估使用全球转录组分析,因此,导致一个更可靠的识别和临床上有用的基因组区域。

司仪:如果谷胱甘肽不编码蛋白质,或rna基因表达的功能,或其他细胞过程,其功能基因组中是什么?

EA:除了蛋白质编码、功能RNA编码、监管和人类基因组的结构区域,其他不那么理解和不活跃的DNA区域存在。

大部分的人类基因组似乎已经进化的各种整合的病毒,因为他们他们的DNA插入真核基因组的几百万年,导致建立庞大的非编码元素,我们继续进行。此外,部分复制功能人类基因导致不活跃的伪基因的形成,占用空间的基因组还不知道熊的细胞功能。

最后,一些人类基因组的非编码部分的功能作用还不是很清楚。搜索安全港口进行了使用现有的人类基因组的注释,以及多个组件的破译基因组区域的识别安全的基因插入将变得更加明智。

主持人:你能讨论为什么基因组的某些区域以前认为是谷胱甘肽但现在公认non-GSHs吗?

EA:没有其他的选择,AAVS1, CCR5和hRosa26网站历史上称为谷胱甘肽,他们支持感兴趣的基因的表达在不同的细胞类型,适用于研究设置。

警告(主要在功能基因的内含子位置,紧密包围其他已知的蛋白质编码基因以及致癌基因)然而阻止他们被用于临床应用。因此,在我们的论文我们不称之为谷胱甘肽,并参考我们作为谷胱甘肽的新发现的网站。

主持人:你彻底基因组扫描来确定候选基因为进一步研究潜在的谷胱甘肽。你能讨论一些你在这里采用的技术方法,为什么?

EA:我们使用多个公开可用的数据库来识别基因组结构的坐标,监管和人类基因组的编码组件根据我们提出的谷胱甘肽标准的开始我们的研究(基因外,致癌基因,lncRNAs等)。我们使用这些坐标和生物信息学工具——如命令行bedtools排除这些基因元素以及地区相邻。这给我们提供了基因组区域——假定的谷胱甘肽,我们可以通过实验验证通过记者和治疗基因插入细胞转录组分析GSH-integrated vs集成式紧随其后。

主持人:你缩小你的搜索测试5个,然后两个谷胱甘肽。你能扩展你的报告基因的选择当评估两个谷胱甘肽在细胞系?

EA:通常在研究你与什么是可用的或最感兴趣的是什么实验室你目前的工作。

我们的情况也不是一个例外,我们最初(直到T细胞工作)的使用mRuby报告基因,因为它被广泛使用,广泛使用在我们的实验室和验证苏黎世联邦理工学院。

当我搬到哈佛,Wyss研究所我开始合作博士Denitsa Milanova很感兴趣,测试这些网站的皮肤基因疗法——尤其是交界表皮松解治疗大疱,突变所引起的各种锚蛋白连接不同的皮肤层,其中的LAMB3基因。出于这个原因,我们决定表达该基因在人类皮肤成纤维细胞,与绿色荧光蛋白表达visualizable确认。我们希望能将这项研究转化为诊所。

主持人:你能描述一下如何利用潜在的谷胱甘肽治疗的例子吗?

EA:目前细胞疗法的方法依赖于随机插入的基因感兴趣的人类基因组。这可能与潜在的副作用包括癌症治疗细胞转化以及最终插入基因的沉默。

我们希望最终过渡到当前单元格疗法治疗基因插入到我们的谷胱甘肽,这将缓解描述问题。特定领域的实现可能涉及安全工程的T细胞对癌症治疗:插入的基因编码受体靶向肿瘤细胞或细胞因子增强抗肿瘤反应的能力。

此外,这些网站可以用于工程的皮肤细胞治疗(正如前面所讨论的LAMB3例子)以及抗衰老应用程序,比如表型表达的基因导致年轻的皮肤。

最后,鉴于基因表达从我们识别的鲁棒性网站,他们可以用于产业规模bio-manufacturing:高产生产蛋白质的兴趣人类细胞系为后续提取和治疗的应用程序(例如,生产的血友病患者的凝血因子)。

主持人:有什么局限性的研究在这个阶段吗?

EA:本研究最主要的限制是基因组的低频集成事件使用CRISPR-based敲入的工具。这意味着细胞中感兴趣的基因成功地融入的谷胱甘肽必须拿出大大大的细胞没有这个集成。

这些孤立的细胞将被扩展到生成同质人口gene-bearing细胞。这样的管道不是理想的临床和基因整合效率的改善需要帮助这个技术更容易转化为诊所。

我们实验室目前正在开发基因工程工具,最终将允许大型基因整合到谷胱甘肽具有高的精度和效率。

主持人:这项研究可能会产生什么样的影响在细胞和基因治疗的发展空间?

EA:本研究希望将导致该领域的许多研究人员测试我们的网站,确认他们在其他治疗相关的细胞类型和最终使用的研究,以及在诊所,更可靠,耐用,安全的替代品,目前病毒基于随机基因插入方法。

此外,因为在我们的工作我们分享我们所有公认的谷胱甘肽被计算管道,我们希望研究人员将尝试测试网站我们还没有验证通过实现谷胱甘肽评价管道,我们概述了。这将导致更多的谷胱甘肽的识别与临床翻译或bio-manufacturing甚至更好的性能。

主持人:在推进这项工作你的下一个步骤是什么?

我们希望有一天翻译我们的成功在体外皮肤结果和开始使用这些谷胱甘肽在活的有机体内上下文。

此外,我们期待提高集成效率到我们的谷胱甘肽,这将进一步支持临床转变我们的网站。

最后,我们将评估的可用性的大规模生产谷胱甘肽治疗相关的蛋白质,从而改善管道制造的生物制剂。

埃里克博士Aznauryan莫莉坎贝尔说,高级科学技术网络作家。捷克葡萄牙直播