哺乳动物细胞培养的微生物污染不仅威胁文化本身的生存能力,它对过程的完整性和有效性提出了疑问的结果数据或产品。细胞培养环境的性质意味着,巧合的是满足众多的营养和生长要求不同的微生物,可造成潜在的威胁。因此,严格的无菌技术必须应用与实施一系列措施旨在帮助预防或快速检测和消除任何污染。

在许多潜在的污染物中,支原体物种提出了特别的挑战。这主要是因为其极小的体积,使得他们很难排除从细胞培养环境和难以检测。理解风险有助于指导缓解策略,其中包括严格的无菌操作,强化过滤的试剂和定期使用最有效的检测方法。

支原体的问题

支原体是已知的最小的独立生存的生物。他们一直被认为是哺乳动物细胞培养的常见污染物,并保持一个重大的挑战在今天的实验室和生物制药生产设施。在2015年的一项研究从多个实验室,为了得到一个公正的评估分析,序列数据从9395年的884系列的啮齿动物和灵长目动物样本NCBI序列读取档案,显示,11%被支原体污染。¹

支原体是区别于其它细菌的极其微小的物理尺寸(0.15 - 0.3µm),小基因组(580到2200 kb)和缺乏细胞壁。它们的大小和多形性的结合使这些生物通过标准0.2µm消毒级过滤器。因为他们没有创造明显的浊度,可以达到高浓度污染的影响通常不是肉眼可见到伤害。缺乏细胞壁意味着他们不易感细胞培养常用抗生素,难以根除。让事情更加复杂的是,抗生素有效可能有毒的细胞培养。

污染支原体可以有几个不同的起源。实验室人员被视为一个重要来源,超过半数的支原体感染导致的细胞培养生物通常发现在人类口咽径。²动物细胞培养添加剂,特别是植物性材料,都可以导致其他类型的支原体。现有的污染细胞系和设备也构成严重威胁。



支原体污染细胞培养中可能会持续多年未被发现。³虽然它并不总是导致细胞死亡,但它可以改变宿主细胞的行为。这可能导致细胞代谢的变化和形态、染色体损伤和畸变,越来越倾向于接受细胞凋亡。可能存在的细胞增殖率下降,降低饱和密度和凝集悬浮的文化。

结果,不可能相信实验数据受污染的文化,使返修绝对的要求。一旦一个实验室证实支原体污染它还需要进行深所有实验室的器具的消毒,设备和表面。通常,大量的材料,可能成为受污染通过接触必须丢弃。因此,支原体污染的细胞培养巨大的金融对实验室和生产设施和生产力的影响。

预防策略

支原体污染的风险管理依赖于保持无菌技术的最高水平和良好的卫生习惯。采取下列一个或多个措施也推荐:低于0.1µm过滤所有细胞培养材料,而不是更传统的0.2µm,错过支原体;采购只有0.1µm预滤器材料;定期检测支原体检测技术,使早期污染发生时采取行动。

从历史上看,过滤的细胞培养基和组件进行了使用过滤器孔径为0.2µm,但现在转向0.1µm。这些严格规范的关键原因之一是增加转向植物细胞培养材料,这实际上是更容易比来自支原体污染,例如,牛血清蛋白(BSA)。⁴图1显示了一个典型的真空过滤机设置一个现代设计保证了较高的过滤效率,快速流率和高吞吐量,在细胞培养实验室保持生产力至关重要,而发挥关键作用在降低污染的风险。

图1:一个典型的过滤设置适用于细胞培养材料使用0.1µm的孔隙大小。来源:热费希尔科学。

今天,扩展数组的媒体和细胞培养组件是作为预滤器产品。当购买这些重要的是要确保所有材料已经µm过滤到0.1。不意外,这样的产品可以溢价。这些设施使用不常见细胞培养基,定制的媒体或媒体附加组件不能总是获得现场预滤器产品,所以必须进行过滤。许多人选择相结合的方法。

常规测试的重要性

采取预防措施以避免支原体污染提供了最佳实践在管理细胞培养,并定期测试,以检查这些措施的有效性是至关重要的。唯一保证检测支原体污染的方法是直接通过测试细胞培养。

所有的测试基本上是被动的;一旦确定了支原体污染,文化已经毁了,任何结果都必须被丢弃。这个问题是加剧了使用传统的挑战为支原体微生物测试。这些都是冗长和结果可能需要28天。最新的快速方法,然而,支持更快确认污染所以研究者知道立即丢弃一批细胞培养,采取必要的补救消毒步骤和重新开始。

这种损害限制意味着更少的工作完成,随后需要重复。pcr进行检测DNA测试现在接受的方法支原体在细胞培养和提供全面的结果在短短几小时。图2显示了典型的采样点在细胞培养过程。这种早期检测不仅减少了需要返修,但也允许快速行动预防支原体的传播到下游设备、流程和媒体。

图2:采样点支原体。可以进行快速pcr检测支原体感染整个细胞培养生产过程,从接种到收获。来源:热费希尔科学。

总之

支原体污染是一个阴险的问题在哺乳动物细胞培养。风险缓解需要采用严格的无菌性实践,支持和严格的媒体过滤的应用标准和常规使用pcr快速检测。

毫无疑问,预防胜于补救。媒体和组件的更有效的过滤的膜孔径0.1µm成为常态,避免问题使用标准0.2µm消毒级过滤器,未能防止支原体的通道。高滤过率和高通量筛选系统方便实验室实施预防策略。

除了这是预滤器日益增长的商业可用性的材料。这些验证和认证材料移除需要进行进一步的过滤。然而,对于许多预滤器细胞培养基可能不是一个选项。现场过滤仍定制媒体和专家所需材料,例如,或满足当地规范。

最后,快速检测支原体的出现和接受意味着实验室可以很容易地进行细胞培养的常规测试和几乎立刻知道如果有污染问题。他们可以迅速采取行动,消除影响文化和防止进一步传播。快速测试相比,特别是与传统的28天与标准微生物测试结果最小化丢失工作,需要返修。

引用:

1. Olarerin-George AO, Hogenesch简森-巴顿。评估的流行中支原体污染细胞培养通过NCBI RNA-seq档案的调查。核酸Res。2015年,43 (5):2535 - 2542。doi:10.1093 / nar / gkv136
2. Nikfarjam L, Farzaneh p .预防和检测支原体污染的细胞培养。细胞J。2021;13 (4):203 - 212。PMCID:PMC3584481
3. ' CC,德雷克斯勒HG。检测支原体污染的细胞培养的聚合酶链反应。:克里族i (eds)肿瘤细胞培养。分子生物学方法(方法和协议)。2011年。胡玛纳出版社。doi:10.1007 / 978 - 1 - 61779 - 080 - 5 - _8
4. 埃克斯J, Meltzer T, Jornitz兆瓦。支原体污染的重演:预防战略。国际生物过程。https://bioprocessintl.com/downstream-processing/filtration/the-reoccurrence-of-mycoplasma-contamination-prevention-strategies-184084/。2月1日,2009年出版。2021年11月17日通过