喜欢简单、特异性和成本效益,ELISA是一个有用的技术用在许多全球实验室。ELISA试剂盒对多种分析物可以购买商业,虽然这些往往是昂贵的和金钱往往是紧张,尤其是在研究环境。这导致许多实验室开发自己的化验,尤其是当工作预算或很多样品需要分析。尽管这项技术的易用性作为一个整体,仍有许多因素被认为是为了设计健壮和可靠的检测。这里有一些我经历了一路,愿分享希望节省你的时间,压力和资金,并帮助你实现最好的结果!

1。明智地选择你的表面

由于蛋白质的多样性在ELISA用于涂料,有广泛的专业微型板块可用各种各样的绑定属性和能力。在开发一个新的试验,一系列的表面应进行评估,以确定哪些是最优抗体/抗原进行测试。大多数板块是由相同类型的塑料如聚氨酯、聚氯乙烯,但它们是由不同的绑定属性。值得尝试几个塑料的低、中、高至少绑定功能。成本也是一个重要的考虑因素在选择塑料,尤其是大量的样品测试。此外,分子用于涂层板应滴定正确确定最佳使用浓度测定。

2。棋盘格

虽然看起来是明智的使用高浓度的抗体测定,尤其是分子被发现不是很丰富的样本,这是违反直觉的。适当的滴定的抗体被用于测定,以及样本,确保信号噪声比最优;目标是有尽可能低的背景尽可能高的光密度(OD)精心设计和敏感试验。使用太多的抗体,背景噪音将是由于非特定的绑定。浓度太低,试验将失去敏感度。一个有效的方法来测试这是进行一系列连续稀释的分子用于涂料、样品,和二次抗体(+其他抗体,比如在设计一个三明治ELISA)和测试这些,为每个条件与消极的控制。这使得每个确定的最优浓度在几个简单的实验。多种类型的塑料也可以同时分析。

3所示。适当的样本稀释是关键

适当稀释的样本调查化验分析变化时常常被忽视。样品使用前需要被稀释的,如使用血清时,逐步稀释最小化误差移液至关重要。例如,如果一个棋盘格实验确定血清应稀释1:10 0除了板之前,明智的做法是1:10稀释的样本,其次是后续1:10稀释。虽然这可能是显而易见的,这通常是不执行,可以创建实验之间巨大的差异,这是令人沮丧的研究员和可以避免很简单,提高分析的可靠性。不适当的稀释也可以创建误导当比较样品在相同的实验结果。例如,如果两个血清样本被确定是否发生血清转化相比,不当稀释样品可能意味着血清转化是错过如果太多的预转换示例添加由于稀释技术差。

4所示。所有的抗体是不平等的

虽然它可能并不总是可能的,感兴趣的多个抗体蛋白质可用,最好每一个测试。有很多需要考虑当选择抗体。多克隆抗体有更广泛的目标范围,通常是便宜的,但可能会降低检测的特异性。单克隆抗体通常更昂贵,但更具体的提供,使用的表位抗原的抗体是可见的利益(但可能不绑定如果不是)。经常测试这个的唯一方法是尝试一系列抗体从不同的制造商。值得庆幸的是,许多制造商为这个目的提供小样本大小,或者愿意提供这些如果问。选择双夹心elisa中使用时,这种选择变得更加重要,因为必须认识到彼此不同的抗原表位的抗体。

5。谨防阻塞惊喜

许多研究人员试验一系列阻止代理在开发阶段的分析和做出选择使用使最好的信噪比。一个因素时,这通常是在考虑这个选择是批次的变化特别的阻滞剂。阻滞剂通常是生物制剂,如牛血清白蛋白(BSA)。BSA是一种非常有效的拦截器在一个广泛的分析,但由于试剂的性质可以批量之间差异巨大,有些批次包含大量的干扰实验的可交叉反应的抗体,和一些包含几乎没有很多。因此,如果一个拦截器如BSA或胎牛血清选择谨慎测试几个批次的一致性检查结果给定一个之前。这是一个重要的考虑因素,对不幸的人往往是许多失败的原因实验一旦批测试最初被使用!批次变化在哪里见过,但拦截器选择不能修改,通常厂商乐于持有特定批次如果咨询和了解将使用多少。

6。批量测试二级抗体

类似于阻止代理、批二次抗体也可以有所不同。虽然他们的整体活动可能不会改变,之间需要可以改变很多。当购买另一批二次抗体,值得运行一个简单的实验与以前的很多,确保所使用的浓度仍然是合适的。假设可以使用同一稀释有时意味着背景噪音突然变得更高的批处理时发生了变化,这可以是一个令人讨厌的惊喜!

7所示。别忘了规范化!

经常被忽视,规范化需要盘子/实验和最小化之间的任何变化对整体结果的影响。之间的一个简单的方法规范化实验血清作为分析物,比较结果为每个血清样品的阴性血清控制。通过这样做,任何变化等外部因素的室温和开发时间最小化。除以试样的OD OD的控制,结果可以表示为一个褶皱的变化。虽然这不是绝对量化,通常是一个绝对数量是没有必要的,但仍然可以获得一组健壮的结果,和样品可以比较。

8。知道你的动态范围

当设计一个实验,用标准曲线确定样品的浓度,重要的是要保持您所使用的仪器的动态范围内读你的盘子。这些值将指定的厂商手册;许多机器的上限是~ 1.5 OD。准备一个标准曲线时,最高标准(即最集中的)必须有一个OD低于最高的动态范围。通过使用标准,坐在上面这个范围内,外推的结果与标准曲线变得危险,任何OD高于这个数字可能不准确的许多新模型板的读者能够调整动态范围,但如果您使用的是一个模型,这是不可能的,最大OD需要标准曲线设计中考虑。所有样品必须也属于这个才能准确地测量动态范围和浓度确定,所以样品稀释也必须被考虑。开始这可能是令人沮丧的,但是一旦运营商对一批样品的浓度范围,它可能是一个标准稀释样品可以使用适合在这个范围内,好为将来的实验结果。