近年来，单细胞测序已成为一种在不同生物学研究领域普遍使用的方法。为什么在学术界和生物技术领域都有这么多研究人员如此迅速采用了这套相对新颖的技术？单细胞测序或单细胞基因组学解决了散装组织测序方法的关键警告，以实现细胞分辨率的分子读数，而无需净化或丰富特定的细胞类型。在广泛采用单细胞基因组学之前，通过从一块组织中分离和测序核酸来进行RNA或DNA测序。由于组织和器官由多种分子多样的细胞类型组成，因此从细胞集合中获取有关RNA丰度或DNA序列变化的信息，掩盖了细胞类型的真实异质性。这是回答基本科学和转化科学问题的关键挑战，因为我们越来越了解正常的身体功能和疾病过程在很大程度上依赖于具有定义角色的特定细胞类型的精心策划相互作用。这些细胞类型特异性功能按其顺序使用，利用每种细胞类型中的各种基因调节网络和基因表达谱。单细胞基因组学一次以公正的方式揭开了一个分子多样性。

在此列表中，我们讨论了单细胞测序方法的类型，其背后的技术将谈论如何将这些技术应用于生物医学科学各个领域的问题，从而导致了新的生物学见解。

单细胞RNA测序

单细胞测序技术不断改进，并已被采用以分析单个细胞的一系列分子特征。RNA测序是最早应用于组织或器官的单个细胞的技术之一。单细胞RNA测序（SCRNA-SEQ）捕获微孔或微孔的单个细胞，并利用逆转录（RT）以及条形码的RT RT DNA引物将每个细胞中的RNA分子转换为条形码互补DNA（CDNA）。逆转录之后是聚合酶链反应，以扩增所得的DNA，然后使用下一代测序对其进行测序。由于所有源自同一细胞的cDNA分子都通过分析来自SCRNA-SEQ实验的测序数据共享DNA条形码（也称为细胞条形码），因此可以估计每个RNA转录物在单个细胞水平上的身份和丰度。一旦知道每个细胞中的RNA转录物的丰度，这些RNA表达曲线就可以通过将细胞与相似谱分组分组，以公正的方式识别细胞类型。这种方法允许鉴定组织中所有细胞类型的基因表达谱。这些包括罕见的细胞类型或细胞类型，这些类型或细胞类型很难使用其他技术（例如细胞分选）从组织中纯化。此外，使用RNA表达谱和有关细胞类型成员身份的信息，SCRNA-SEQ可用于确定在特定条件下在每个单独的细胞类型中发生的基因表达变化，例如在疾病中。

SCRNA-SEQ已成功地应用于生物科学中的众多问题。由于哺乳动物大脑中的细胞类型大量，以及使用常规技术净化和研究它们的挑战，最富有成果的是它将其应用于神经科学。SCRNA-SEQ已被用来在单细胞分辨率下创建发展中人脑的地图集，从而创造了一种强大的资源，以了解正常的人类中枢神经系统如何发展以及如何在神经发育疾病中扰动特定细胞类型的分化和成熟。

此外，SCRNA-SEQ的变体称为单核RNA测序（SNRNA-SEQ），最近允许研究人员识别成熟的人和小鼠大脑中的细胞类型及其分子特征。SNRNA-SEQ可以通过对单个细胞核的RNA测序，将SNRNA-SEQ应用于验尸后脑组织或难以分离的细胞类型，例如成熟的神经元。¹了解成年人脑的细胞类型组成进一步为影响影响其的疾病（例如脑损伤和神经退行性疾病）开发靶向细胞和药理学疗法的方式铺平了道路。

Additionally, snRNA-seq has been applied to directly study human brain disease by profiling normal brain tissue and brain tissue of patients affected by a neurological disorder. As such, snRNA-seq study of autism spectrum disorder (ASD) discovered that a specific subtype of neurons in the human brain cortex change dramatically in this disease.²In another study, snRNA-seq has been used to identify how specific neuronal and glia cell types respond and change in multiple sclerosis lesions. ³

用于表观遗传分析的单细胞测序

表观遗传学是一个快速发展的领域，重点是研究基因调节机制，通过改变染色质状态（DNA-蛋白质复合物），该机制可控制基因的表达，这是DNA-蛋白质复合物，用于包装细胞中的DNA。染色质存在于两个主要状态：斑塑素（也称为开放染色质）和异染色质。开放染色质区域中的基因通常具有转录活性，而异染色质区域中的基因被沉默。除染色质状态外，基因表达还通过DNA的化学修饰直接调节，最常见的是通过胞嘧啶碱的甲基化。包含基因的DNA的甲基化通常会导致基因沉默。表观遗传学领域的进展越来越多地表明，DNA甲基化和色谱是高度组织和细胞类型的特异性。值得庆幸的是，单细胞基因组学的最新发展为科学家提供了分析单细胞表观遗传状态的方法，该方法通过对转座酶易于访问的染色质进行单细胞测定，然后进行测序（SCATAC-SEQ），揭示了开放染色质的区域，以及单个染色质的区域，以及单个细胞。- 细胞DNA甲基化分析。

scATAC-seq has already proven instrumental in understanding how specific cell types in various tissues develop and how these developmental programs go rogue in disease. This technique has been used to understand how epigenetic signatures of the stem cells, neuronal and glial cell types in the developing human brain⁴小鼠视网膜随着细胞的分化和成熟而变化。⁵为了理解疾病发病机理，SCATAC-SEQ确定了由1型糖尿病中记忆T细胞维持的表观遗传程序，并介导自身免疫反应性。⁶此外，SCATAC-SEQ已被用来洞悉表观遗传调节在各种癌症的发病机理中的作用，包括三阴性乳腺癌⁷and acute leukemia.⁸

Single-cell sequencing for immunology

自适应免疫系统依赖于T和B细胞克隆产生T细胞受体（TCR）和可以与巨大抗原曲目结合的抗体的能力。这种令人难以置信的多样性是通过编码TCR和抗体链的基因的随机重排和超突变而发展的，然后选择T和B淋巴细胞，以消除对体内自我抗原反应的细胞。这个过程产生了估计的多样性10¹⁵-10²⁰对于TCR和3×10¹¹for antibodies. Each T or B cell clone expresses a unique TCR or antibody, and upon reaction to a foreign antigen (such as from bacteria, virus or a cancer cell), this clone undergoes a massive number of cell divisions. Since the nucleotide sequence of a TCR or an antibody chain can be used to produce more T cells and antibodies for therapeutic purposes, or even to predict the target antigen, understanding this sequence is a crucial challenge in immunology. Due to the clonal nature of TCR and antibody diversity, a single-cell approach is best suited to understand the mechanisms at play.

最近已经应用了单细胞B细胞分析，以通过对COVID-19患者中产生抗体的B细胞的单个克隆进行测序，以鉴定针对SARS-COV-2的中和抗体。⁹这一令人鼓舞的新发现突出了单细胞免疫分析的力量，成为发现传染病治疗抗体的主要驱动力。鉴于免疫系统在肿瘤发生和转移中的重要性，单细胞免疫分析的另一个高度有希望的应用是癌症生物学。最近，该技术还用于了解特异性TCR在肾细胞癌患者中的预后意义以及T细胞异质性 pediatric sarcoma. Nicole Velmeshev, assistant professor at the San Francisco State University, argues that single-cell immune profiling presents a great promise in developing new treatments for various types of cancer. Given that suppression of immune reactivity is one of the key mechanisms by which cancer cells evade hosts defenses and taking into account the immense success of immune therapy in many types of cancer, the ability to understand which exact T cell receptors or antibodies target cancer cells is crucial, says Dr Velmeshev. According to her, once we can obtain this information rapidly for each individual cancer patient and for each tumor, we will be able to develop targeted therapies, such as chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell or antibodies, that are highly effective in killing the specific individual’s cancer cells.

多词与单细胞测序的未来

最近，单细胞测序技术使研究人员能够从同一单细胞中获得多个分子读数。例如，联合单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序可以同时测定单个细胞的转录和表观遗传谱。由于标记基因的RNA表达谱在确定细胞类型方面具有很高的信息性，因此该组合RNA和开放的染色质分析允许以公正的方式鉴定特定细胞类型的表观遗传谱。此外，通过分析细胞类型内部和跨细胞类型内和开放式染色质特征的变化，可以得出关于表观遗传调节对各种疾病（例如疾病病理或细胞分化）基因表达的影响的结论。

In addition to nucleic acids, single-cell sequencing now allows quantifying abundance of a pre-determined set of proteins on the single-cell level using barcoded antibodies. Since protein levels are most correlated with cellular functions and are not always in perfect agreement with RNA expression due to multiple levels of post-transcriptional regulation, this readout is instrumental in analyzing such fast-pace cellular processes as immune cell activation. Since protein quantification in single-cells is currently limited to tens of proteins at a time, this approach is combined with genome-wide assessment of RNA expression.

参考

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