Transcriptome-focused研究已经走过了漫长的道路问世以来北方污点在1970年代之后,定量聚合酶链反应(qPCR)和微阵列技术。近年来,新一代测序的发展(门店)的技术彻底改变了科学家分析基因的表达和调控。RNA序列(RNA-seq)使用门店探测、量化,转录组和概要文件。与旧方法相比,RNA-seq提供更高的分辨率和覆盖,至关重要的是,不需要先验知识的转录组分析。这将打开门新创发现。这些进步是允许科学家不仅量化基因表达,但发现新的成绩单,可变剪接网站,和等位基因¹。RNA-seq帮助降低设备成本的广泛使用,使这种分析能够很容易地和在几乎每一个科学和医学领域带来突破性的发现包括神经科学。

科技进步在神经科学是非常需要这样的技术来解决限制科学家工作时遇到在人体最复杂的器官。此外,而神经系统的最高水平是人体细胞异质性的任何系统,这个细胞多样性的重要组成部分和长距离的连接仍然很大程度上未被发现的。克服这些限制依赖大规模的开发和实现,精密技术,如RNA-seq适应神经科学。

这种技术进步的长期目标就是提供更好的理解大脑的生理环境,分析其转录组,并链接到大脑的独特的生理。确定这些机制在一个健康的环境将速度启示的疾病表型和生物标志物和支持对于神经系统疾病药物发现。比利时罗马尼亚比分直播

在这个列表中,我们探索的主要方向RNA-seq技术用于神经科学和他们的贡献。

1。单细胞RNA序列(scRNA-seq)

解决大脑的细胞异质性的问题需要系统的探索在单细胞水平上。顾名思义,单细胞RNA-sequencing (scRNA-seq)由单个细胞的基因表达分析。

scRNA-seq工作流首先分离单个细胞从一块组织通过微流体系统、激光捕获显微解剖,或荧光激活细胞分类(流式细胞仪),最后一个是最常用的技术。这种孤立的材料成为起点RNA-seq分析RNA组成的隔离和mRNA浓缩,其次是碎片,转换成互补DNA分子(互补),以及测序适配器。适配器的互补结合形成“DNA库”将测序和分析。自2009年引入的方法²,不同平台的开发scRNA-seq为研究人员提供了选择找到最佳解决方案的特定项目的细胞隔离方法,吞吐量水平,覆盖面和敏感性³。

2。Patch-seq

神经元膜电位是一种兴奋性神经细胞的基本特征与膜片箝技术,可以解决。膜片钳由测量细胞的电特性使用微量吸液管与细胞膜的紧密联系⁴。RNA-seq的技术进步是导致许多brain-specific RNA-seq方法包括patch-seq。它提供的全细胞膜片箝记录RNA-seq分析相同的孤立的神经元。在经典电生理学记录⁵、细胞rna提取并测序。最初成立于2015年⁵,过去的五年里已经看到创新的实现更加精确和分化等RNA-seq测量涉及不仅胞质rna还远rna本地化树突和轴突⁶。Patch-seq可以应用到不同的大脑区域,给出了一个非常准确的视觉整个转录组的单个神经元的不同部分。同时patch-seq仍处于起步阶段,这些特性使得该方法非常有前途的学习障碍与远端RNA, RNA贩卖。

3所示。荧光原位测序的RNA (FISSEQ)

时空调控蛋白表达正常大脑功能和发展至关重要。途径中调节蛋白质亚细胞定位,信使rna定位成为主要机制确保正确的蛋白质在神经细胞分布⁷。研究RNA贩卖沿神经元对于理解大脑功能是至关重要的。最初,这个问题已经接近使用原位RNA分析。这项技术的最大约束是局限于少数好的注释生物标记。2015年,乔治教堂Wyss研究所的团队努力克服这个问题通过开发FISSEQ(荧光原位测序的RNA)方法⁸。FISSEQ序列原位整个一个固定的细胞或组织的转录组和链接与空间定位给定分子的表达水平。技术由逆转录(RT)反应的固定样本,将RNA转换成一个互补DNA(互补)。互补脱氧核糖核酸分子是阅读前放大反应发生在分子的水平,结合荧光信号,可以通过共焦显微镜进行分析。FISSEQ协议适用于大范围的样本,包括培养细胞,福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和新鲜冷冻组织样本,包埋果蝇胚胎,瀑样⁸。

4所示。多路复用分析预测的测序(MAPSEQ)

通过突触神经回路组神经元相互连接,可以在远端位于大脑区域,但在功能上是相互联系的。经典的方法追踪神经回路的连接依赖注入神经元的染料可以检测到显微镜。最近,安东尼Zador的团队开发了一种新方法来跟踪单个神经元电路⁹。多路复用分析预测的测序(MAPseq)由注入RNA 30 bp的条形码序列目标大脑区域。每个条形码将绑定一个分子,通过单个神经元轴突路径最终突触的目的地。之后,大脑解剖切片和条形码mRNA分子提取并测序,给每个编码RNA的电路模式的信息从源区域。这种新方法大大降低了单神经元投影分析和时间大大增加神经元的数量进行分析。

5。条形码解剖学通过测序(BARSEQ)来解决

2019年,Zador团队介绍了MAPseq的升级版——页码解剖学通过测序(BARseq)来解决¹⁰。类似于其祖先,BARseq涉及高通量映射使用RNA-targeting条形码的大脑回路。这里的新奇是执行排序原位而不是MAPseq,大脑是切成薄片和rna提取并测序。这一修改给更高的空间分辨率条形码的初始位置和跟踪电路相比,MAPseq的一个实现。Zador和他的团队继续努力下一代RNAseq-based映射技术,将使我们更接近理解大脑连接健康以及神经系统疾病。

结论

革命RNA-seq方法包括趋势出现在许多研究领域,专注于高通量,单细胞技术。我们可以看到,RNA-seq技术也发展的更有针对性地寻找解决方案最突出的局限性在今天的神经科学。当涉及到大脑,新技术正在试图把RNA-seq与其他参数的关键神经功能,如电活动、本地化的信使分子,组织或神经电路。

的快速进展,这些方法的发展,科学家们希望更好地理解复杂的结构,流程和大脑的通信,希望它将带来新的治疗方案在接下来的几年里。

引用:

1. 王,Z。,Gerstein, M. & Snyder, M. (2010). RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.Nat。启麝猫。1057 - 63。
2. 唐,F。et al。(2009)。mRNA-Seq whole-transcriptome单个细胞的分析。Nat方法。6,377 - 382。
3. 亩,Q。,Chen, Y. & Wang, J. (2019). Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing.基因组学。蛋白质组生物信息学17,344 - 366。
4. 济夫,一个。,Garcia-Oscos, F. & Kourrich, S. (2016). Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.j .粘度实验。2016年,1 - 10。
5. Cadwell, c R。et al。(2016)。电生理学、转录组并使用Patch-seq单一神经元的形态学分析。生物科技Nat。》。34,199 - 203。
6. 范·登·向克,M。欧文,j . A。唷,g·W。,Gage, F. H. & Bardy, C. (2019). Corrigendum: Patch-seq protocol to analyze the electrophysiology, morphology and transcriptome of whole single neurons derived from human pluripotent stem cells.前面。摩尔。>。12,11 - 12。
7. Zappulo,。et al。(2017)。RNA neurite-enriched蛋白质组的定位是一个关键的决定因素。Nat。Commun。8,1 - 12。
8. 李,j . H。et al。(2015)。原位荧光测序(FISSEQ) RNA的基因表达分析完整的细胞和组织。Nat。Protoc。10,442 - 458。
9. Kebschull, j . M。et al。(2016)。高通量单神经元预测序列的编码RNA的映射。神经元,91年,975 - 987。
10. 陈,X。et al。(2019)。高通量的映射远程使用原位测序神经元投射。细胞,179年772 - 786. - e19。