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COVID-19大流行已经显示出整个世界是多么关键的病毒研究。年的工作调查SARS和其他冠状病毒被证明是无价的基金会,允许研究人员确定SARS-CoV-2突起蛋白的结构和快速开发疫苗挽救了无数的生命。

在许多方面,病毒学领域正在经历一场复兴,无数的基本技术有迅速发展在过去的十年。的重要因素,除了增长催化的全球大流行,是低温样品保存的标准化和商品化和分析。在本文中,我们将讨论的集成低温电子显微镜(低温电子显微镜)病毒学研究和工作所带来的独特的挑战与危险病毒物种在生物安全实验室。

早期的病毒分析

从历史上看,已保存细胞和病毒样本通过化学固定或结晶。在整个病毒分析是不切实际或不可能的,深入的样本分为关键蛋白质结构分析。虽然这些技术提供了宝贵的见解的结构、行为和功能的病毒,他们脱离原生环境病毒行为。虽然这是接受隔离,成熟的病毒粒子,它留给我们的差距我们理解virus-cell交互,特别是一旦内化病毒进入细胞。

重组病毒复制的细胞机制是一个复杂而高度瞬态过程。即使细胞内成像是可能的化学固定,捕捉这些稍纵即逝的事件是具有挑战性的,尤其是与足够的细节deconvolute正在发生什么。

低温电子显微镜

在低温样品制备,水迅速冷冻标本为了保全他们暂停无定形冰(玻璃)。与水晶冰扩展形式,玻璃冰分子一般留在液相仓位,保持周围的分子结构的样本。这本质上需要一个“快照”的标本在一个本地的状态。

病毒分析,低温保存仪器发展的一系列电子显微镜技术,大致描述为低温电子显微镜。其中最常见的是单粒子分析,其开发人员授予2017年诺贝尔化学奖。单粒子分析使用平均生产三维分子结构的二维透射电子显微镜(TEM)不同的副本的图像样本,面向内随机冰。它广泛被认为是赠送的x射线晶体学,因为它可以很容易地生成结构蛋白和复合物具有挑战性的结晶。

在单粒子分析填补了一个重要的细分市场结构分析的世界里,它仍然是分散的系统上执行孤立的从他们的生理环境。幸运的是,这需要原位观察可以通过另一个互补的低温电子显微镜技术,低温电子断层扫描(cryo-ET)。

冷冻电子断层扫描

在电子断层扫描,薄样本是逐渐倾斜和成像在TEM。这些图片代表不同的横截面上的样本,可以组合成一个单一的高分辨率的3 d表示标本。而单粒子的分析依赖于许多副本相同的目标分子捕获它的各种方向,断层扫描必须使用精确可靠地阶段,倾斜一个样本在离散增量。

值得注意的是,这意味着cryo-ET可以在执行一段整个细胞低温保存。虽然早期cryo-ET实验仅限于固有的薄样品(或更厚的样品薄地区),出现各种cryo-thinning技术允许“windows”直接切成冷冻细胞窥视他们的细胞内的机械。

对于病毒学,这提供了一个独特的机会来捕捉难以捉摸的病毒进入细胞的细胞质后当场抓住。特别是,cryo-ET一直用于研究细胞内冠状病毒复制的行为。在一个由莱顿大学医学中心的合作,研究人员能够可视化病毒诱导形成双层膜的囊泡病毒RNA复制用于庇护。这包括孔隙结构表面的囊泡可能负责RNA运输,将它们标记为潜在的药物靶点。

脊髓灰质炎病毒复制的低温电子断层扫描揭示小说的特征。

x线断层照片poliovirus-infected海拉细胞的三维可视化。空衣壳:粉红、RNA-filled衣壳:红、蛋白复合物拘束衣壳膜:黄色,管腔内的密度:橙色,和致密颗粒co-packaged病毒粒子:蓝色。图片由塞尔玛Dahmane、于默奥大学的。

生物安全实验室,与敌人合作

Cryo-ET致病的病毒,virus-cell交互,自然是极大的兴趣研究人员由于明显而现实的危险,病毒性病原体对全球人类健康。

然而,生物安全实验室已经定义了各种病毒样本存在的离散程度的风险。工作的病原体构成威胁疾病需要更高的生物安全防范设施,除非工作局限于孤立的蛋白质或灭活样本。确保每个人都在这些设施的安全,研究人员必须采取具体的措施和遵守特殊协议,包括不同的仪器要求(如集去污水平)。因此,高端低温电子显微镜仪器还没有在这些更高的生物安全水平的实验室设施随处可见。

然而,一些实验室的探索取得了可喜的成果病原物种。例如,卡尔森Umea大学研究小组使用肠病毒cryo-ET研究脊髓灰质炎病毒作为一个模型。在他们的工作,他们可以捕捉很多病毒的复制周期内它的宿主细胞。他们观察到病毒的方式改变了细胞内环境促进病毒复制。通过可视化这些离散的机制,他们也能看到细胞防御机制之间的相互作用和病毒组装。例如,自然自噬的抑制因素允许病毒继续复制,尽管细胞触发摧毁他们。这个工作,只是可能由于cryo-ET,打开激动人心的途径,不仅在治疗的发展,但在我们基本的宿主-病原体相互作用的理解。

“想象一下病毒接触的主机后,细胞结合,通过复制和发布。十年前这可能被认为是一个不切实际的梦想,但我们正逐渐接近一个更完整的理解病毒的行为。” 塞尔玛Dahmane,玛丽Skłodowska-Curie博士后, 于默奥大学

Cryo-ET打开大门的新见解都“知道”病毒的结构可能已经确定,以及大量的病毒还有待研究。许多问题关于他们的生命周期和与宿主细胞的相互作用仍然悬而未决。旁边的决心病毒结构本身,低温电子显微镜,包括cryo-ET,使近距离观察病毒在宿主细胞的生命周期,例如,条目,复制、装配和释放。也要学习如何细胞反应和抵御病毒感染。同样,研究药物或药物的影响候选人病毒生命周期和细胞防御可以让我们对未来主要病毒做更好的准备。

视角

病毒学即将进入一个新时代的发现与near-native-state观察通过低温保存和分析。尤其是低温电子断层扫描,可以提供见解,我们当前的知识分子结构和桥梁细胞相互作用。安装低温电子显微镜更高一级生物安全设施将使研究更广泛的病毒种类。与一个完整的、多尺度的理解病毒行为我们可以设计更好的,更有针对性和有效的治疗方法。访问这个信息不会没有挑战,但实验和仪器开发人员的共同努力一定会把我们开始这个令人兴奋的未来。

关于作者

亚历克斯Ilitchev是领导科学编辑,材料和结构分析,在热费希尔科学。

克里斯蒂安Wadel产品营销经理,材料和结构分析,在热费希尔科学。