多年来，冷冻保存一直是保存生物标本的主要方法。它允许研究人员使用几十年前的稀有或珍贵样本来回答新的研究问题。如今，它用于保留最新的复杂细胞模型，以供其他科学家使用，对于生物疗法的储存和供应至关重要。在本文中，我们探讨了冷冻保存以及可以改善这些方法的新兴进步所面临的挑战。

什么是冷冻保存？

冷冻是“霜”和冷冻保存从字面上看，在非常低的温度下涉及冷冻细胞，组织，器官或任何其他生物材料。

有几种实现这一目标的方法：研究实验室中使用的最常见方法是使用固体CO在–80°C下冷冻样品₂或使用液氮-196°C。但是，一种称为玻璃化的方法用于冻结临床样品，例如精子，受精卵或卵巢组织，用于长期储存。主要区别在于，传统的冷冻保存方法允许在保存过程中形成冰，而在玻璃化过程中，整个溶液在没有任何冰结晶的情况下被固化。¹在本文中，我们将重点关注实验室中最常用的传统冷冻保存。

冷冻保存的应用

传统的冷冻保存是一种用于存储细胞和组织的高效方法，它通过将细胞保存在“悬浮动画”中，如 Sameena IqbalWellcome Sanger Institute的Bioresource经理解释说。“通过冷冻细胞，它可以停止代谢活性，并保留酶等细胞内的化合物。”

如果没有冷冻保存，则必须在连续培养中保持细胞和组织的活力 - 这意味着生长并拆分它们以产生更多的细胞（称为传代）。但是细胞随着时间的推移而变化，这会导致它们失去重要特征。通过冻结它们，它可以减少异质性，否则将通过反复传播它们来引入。

“从我们的角度来看，冷冻保存使我们能够为研究界的新蜂窝模型融为一体，人们可以回到未来几年。”夏洛特海狸博士，惠康桑格学院（Wellcome Sanger Institute）的高级科学经理，他开发了像器官等复杂的细胞模型系统。“这意味着我们可以长期保持模型，但是他们并没有不断分裂到它们突变以勉强代表您开始使用的单元的地步。”

冷冻保存变得越来越重要的一个领域是快速新兴领域基于细胞的疗法：例如，保留用于治疗癌症的移植或嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）的间充质干细胞。使用CAR-T细胞疗法，将患者的T细胞去除，重新设计以识别抗原（例如与肿瘤相关的抗原），然后返回给它们。“您必须在这些细胞上进行很多处理，可能会在站点之间移动细胞，将它们捐赠给实验室，然后再回到患者时将它们从患者捐赠给患者，然后再回到患者，并且细胞可以很容易地降解，”解释说马修·吉布森教授，沃里克大学的生物材料科学家。“像理想情况下一样，需要以一种格式冻结的治疗方法，使您可以快速在床边解冻，然后将其施加给患者。一旦您必须在医院环境中进行大量处理，就会造成障碍，所有这些步骤都会引起巨大的成本。无论如何，这些都是极其昂贵的疗法，因此使该过程更有效的任何事情都会使冻结后更健康的细胞恢复健康。”

冷冻储存动物细胞培养物

维持健康的，增长的细胞培养是一项艰巨的任务，由于事故或污染的损失风险，使其变得更加困难。可以通过使用低温保存来减少这些问题，该过程有效地将细胞置于真正的悬浮动画中。下载本指南，以发现细胞冷冻期间细胞内和细胞外事件以及冷冻细胞培养物的优势。

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冷冻保存的局限性

当前冷冻保存方法的主要局限性之一是冻结后的细胞恢复速率。在研究项目中，您可能有时间等待细胞的数量增长，例如上述临床应用，这根本是不可能的。

在冷冻过程中，样品中形成冰晶，并损坏细胞和一些细胞永远不会恢复。大多数实验室和临床方案都使用冷冻保护剂来保护细胞免受冰晶和/或受控速率冻结和解冻，以避免随温度突然变化而震惊细胞。

有许多不同的冷冻保护剂可用，但是用于哺乳动物细胞和组织的最常见的冷冻保护剂是二甲基亚氧化二甲基亚氧化物（DMSO）。其他选择包括用于细菌细胞和红细胞的甘油。但是冷冻保护剂有自己的缺点。DMSO被认为是最好的保护剂，但在某些浓度下它对细胞有毒 。甘油对细胞更友善，但与DMSO相比，甘油作为冷冻保护剂的效果较差。²缓解潜在毒性问题的一种方法是使用不同的冷冻保护剂组合，例如补充甘油或聚丙烯乙二醇的DMSO较低浓度。²

还有一些主要的细胞类型，只是不喜欢在冷冻保护剂溶液中冷冻，这可能会带来挑战。Iqbal解释说：“急性髓样白血病周周单核细胞比淋巴瘤细胞更容易冻结和恢复，因此，如果您冻结了您尚不知道恶性肿瘤的样品，那么您需要非常仔细地对待它们。”“同样，不同类型的健康血细胞冻结不同 - T细胞可能会恢复良好，尽管它们的功能可能会受到损害，而粒细胞根本无法恢复。”

海狸解释说：“借助来自患者样品的类器官，例如类型的类型模型，我们就有失去模型的危险。”“使用类器官的优点之一是它们由代表您在组织或肿瘤中看到的自然异质性的不同细胞群组成。冻结使它们穿过瓶颈，如果该瓶颈对于某些细胞来说太苛刻了，那么您会失去这种异质性，而且不再是一个很好的模型。”

另一个考虑因素是样本的最终使用。For example, RNA is much more sensitive to temperature changes than genomic DNA, as Beaver says: “People have dug up skeletons from years ago and still managed to sequence all the DNA, whereas RNA will degrade if it’s in a – 80°C freezer that's been opened too many times!” This poses a problem for freezing samples if you don’t yet know how you plan to use them.

伊克巴尔说：“如果您的组织非常有限，那么随着分析方法的改善，您必须决定保留此材料的最佳方法。”“我记得我大概是18年前开始的时候，我们将获得非常大的淋巴结活检，其组织比我们可能使用的更多，因此能够以多种方式保存，而现在，核心活检很普遍，因此您已经诊断了用于研究目的的材料非常有限。”

细胞冷冻保存的基础

冷冻保存已成为生物医学研究和临床医学的常规实践。当冷冻并正确保存时，标本可能会无限期地保持悬浮的细胞代谢状态，并可以根据需要解冻。为了获得这一过程的好处，重要的是要对冷冻保存的关键方面进行透彻的了解。下载本指南，以进行研究和临床用途的细胞冷冻保存基础。

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冷冻保存的进展

海狸说，有两个主要的进步可以改善冷冻保存。“中端自动化是市场中缺少的。即使您只冻结了30至50个小瓶的东西，而且不一定是每天，但从人体工程学上来说，对于实验室中的人们来说，这仍然是一个挑战。”除了机器人外，要改进的另一个区域是找到DMSO的替代品，这可能对细胞有毒。胎牛血清通常与DMSO一起使用，以提供进一步支持细胞的蛋白质。但是，例如，这些对于冷冻干细胞而言并不理想。“如果有活细胞划分了您不希望它们的路线，那么拥有活细胞就没有意义了。而且，如果您将这些细胞注入这些人，例如，对于细胞移植，那么您将需要一个不是动物衍生的血清替代品。”

吉布森同意：“基于DMSO的冷冻保存是一种很好的方法，但我们确实需要考虑事物的效率。”“对于许多细胞类型，我们通常使用标准方法冻结，在冷冻后，我们可能只能在20％到60％的细胞之间获得。如果我们可以使这个数字更高，那么我们可以从冰箱中去除较小的批次，或者使用稀有细胞或原始单元，而稀有细胞或原始细胞更难培养和扩展，那么您恢复的越快速度就可以进行研究，或您可以进行更多实验。”

为了满足这一需求，吉布森正在研究仿生材料，他们一直在模仿的蛋白质之一称为抗冻蛋白或结合冰蛋白。³“这些是蛋白质，以某种方式设法选择性地结合冰。他们可以分辨出液态水和冷冻水之间的区别 - 这是非常了不起的。”这些结合蛋白质是由大量物种生产的，这是地球杆上发现的最著名的鱼类。蛋白质结合冰晶体以阻止它们生长，使鱼在较低的温度下比没有蛋白质的鱼生存。“事实证明，有很多蛋白质和多糖可以使冰形成或阻止形成冰的形成方式和何时形成。如果我们可以用合成聚合物模拟这一点，那么我们可以改变如何通过自然在寒冷中保护自身启发的细胞的方式。”该团队已经表明，他们可以在冷冻细菌细胞的同时使用聚合物减少冷冻保护剂的量。⁴

吉布森说，另一个进步是能够冻结已经附着在组织培养板上的细胞。“有了悬架的牢房，您必须将它们放在板上，并让它们生长，然后才能使用它们。我们对如何在这些板上冷冻细胞感兴趣，以便您可以将它们从冰箱中取出，并且可以使用。”吉布森（Gibson）的实验室已经开发了一些材料，这些材料不是通过影响冰而而是通过在冻结过程中有效保护细胞的材料。⁵“我们发现这些非常显着的细胞恢复水平。我们最令人兴奋的结果之一是将多型聚糖添加到单层中的细胞中，附着于组织培养的塑料上，我们看到从<20％到> 80％的细胞被回收的细胞急剧增加。”⁶

这项对冰冻科学的研究不仅限于生命科学 - 它也适用于从使冰淇淋味奶油和较少的脂肪到避免冰冻到冻结的所有事物 - 对混凝土的损害。⁷

“如果您可以使研究更有效，那是一个很好的结果，但是这样的研究也有助于解决有关这些低温如何影响生活以及我们如何更好地存储事物，更有效地的基本问题。”

参考

1。 Tavukcuoglu S，Al-Azawi T，Khaki AA，Al-Hasani S等。是冷冻保存的玻璃化标准方法。中东受精。Soc。J.2012; 17：152–156。doi：10.1016/j.mefs.2012.07.007。

2。 Awan M，Buriak B，Fleck R等。二甲基亚砜：自冷冻生物学黎明以来的核心参与者，毒性是否平衡了疗效？2020年再生医学；15（3）doi：10.2217/RME-2019-0145

3。 Carpenter JF和Hansen TN。防冻蛋白在冷冻保存过程中调节细胞存活：通过影响冰晶体生长的介导。美国科学院校。1992; 89（19）：8953–8957。doi：10.1073/pnas.89.19.8953

4。 Hasan M，Fayter Aer，Gibson MI。冰结晶抑制聚合物可实现无甘油的微生物冷冻保存。生物大分子2018; 19（8）：3371–3376。doi：10.1021/acs.biomac.8b00660

5。 Stubbs C，Bailey TL，Murray K，Gibson M.多型聚糖作为新兴的大分子冷冻保护剂。生物大分子2020; 21（1）：7–17。doi：10.1021/acs.biomac.9b01053

6。 Bailey TL，Stubbs C，Murray K，TomásRMF，Otten L，Gibson MI。合成的可扩展聚（两性小解），可显着增强细胞冷冻保存。生物大分子2019; 20（8）：3104–3114。doi：10.1021/acs.biomac.9b00681

7。 Frazier SD，Matar MG，Osio-Norgaard J，Aday An，DeLesky EA，Srubar WV。通过模仿大自然的防冻剂来抑制水泥糊和混凝土中的冻结损伤。细胞报告物理科学2020; 1：100060。doi：10.1016/j.xcrp.2020.100060。