几乎三分之一世界各地的细胞系都被支原体属细菌污染。这些细菌对分子生物学家的滋扰长期存在几乎影响细胞生理的所有方面，并且经常会影响影响研究结果。但是现在基因疗法正在进入诊所，支原体威胁着研究结果和病人的生活。

如今，大多数基因疗法使用腺相关病毒（AAV）作为其核酸输送载体。AAV在细胞培养物中生长，并且由于支原体细菌通常在细胞培养物中发现，基因疗法批处理易受污染。如果未发现并在基因治疗产生的早期发现并筛选出这些细菌，则可以吸引他们。

一种支原体物种，M.肺炎，是致病性的。该物种会导致大约200万个案件细菌性肺炎和100,000次住院每年。一些生物学家将其称为细菌的“蟹草”因为它普遍存在，难以检测，并且在患者中很难治疗。

随着越来越多的患者接受AAV的治疗，这种细菌有可能影响更多的生命。因此，生物制造商需要敏感的工具来在整个开发和制造过程中测试支原体，以确保细菌不吸引患者。

检测和去除方面的挑战支原体

支原体细菌无处不在，从动物来源的细胞培养基到实验室大衣，很容易逃避检测。t嘿，跨越2-3 µm，太小，无法通过标准的光显微镜镜头看到。它们很小每毫升107个细胞不影响文化的外表。

即使在发现后，支原体细菌也很难从细胞培养物中清除。由于它们是革兰氏阴性的，因此它们对科学家通常用来清除细菌污染细胞系的β-内酰胺抗生素具有抗性。机械分离也是一个挑战，因为它们的尺寸很小，使他们可以轻松地通过过滤器。

相反，科学家求助于直接发现支原体，因为他们唯一的希望筛选了受污染的基因疗法批次。传统上，科学家使用了各种方法为了检测这些细菌 - 使用肉汤或琼脂测试菌落生长，染色或标记其遗传物质或寻找支原体蛋白。但是这些方法可能需要一个月的时间才能提供结果，这可能会严重减慢制造业。定量PCR（QPCR）一天可以检测到支原体，但是该工具使用标准曲线来估计样品中的支原体水平，从而降低了技术的敏感性。

液滴数字PCR作为MYCOPLASMA检测工具

液滴数字PCR（DDPCR）技术也可以快速提供结果，但是与QPCR不同，DDPCR可以直接测量分支机构水平，从而更加敏感。

DDPCR技术涉及将10 µl核酸样品分配到20,000个均匀的1-NL液滴中，并在每个液滴中进行单独的反应。每滴仅包含一个或几个核酸链，该技术使研究人员可以同时对单个DNA链执行数千次PCR。含有目标序列的液滴将在PCR扩增后发出强荧光信号，而不包含序列的液滴仅会发出弱荧光。使用泊松统计，该软件计算了正滴和负液滴的数量，以得出原始样品中靶核酸的浓度。

DDPCR测定使用基于探针的化学并采用三个引物，与qPCR相比，非特异性DNA扩增的发生。通过以这种方式量化支原体DNA，生物制造商可以更确定存在或不存在支原体在他们的样品中提供更安全的基因疗法。

在一个最近的研究研究人员测试了DDPCR技术以敏感性和特异性检测支原体的能力。小组检查了自然界中发现的三种原型物种：A. laidlawii，，，，M.肺炎， 和M. Hyorhinis。他们发现这三个的检测极限（LOD）始终较低：A. laidlawii为4.19基因组副本（GC）/井，M.肺炎是6.29 gc/well，这是M. Hyorhinis是5.63 GC/井。实际上，在直接比较中，DDPCR技术检测到A. laidlawii1个菌落形成单元/mL的标准，而QPCR则没有。

这些研究人员还通过将三种支原体物种的检测与检测三个对照物种的检测进行比较，测试了交叉反应性：C.孢子虫，，，，嗜酸乳杆菌，，，，和S. Bovis。他们确认他们的DDPCR分析只能检测到支原体。

对M的需求日益增长YCOPLASMA基因治疗开发中的测试

当基因疗法进入诊所时，困扰实验室研究的一些污染挑战也是如此。例如，由于某些支原体物种会引起人的疾病，因此必须先筛查基因疗法，以便在将它们送给患者之前。尽管基因疗法开发的复杂性，但当今的生物制造商仍可以使用他们所需的工具，以确保其治疗质量。DDPCR技术是这些工具之一，它可能在确保基因疗法对所有人安全有效方面发挥重要作用。