严重的急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-COV-2）已导致全球2019冠状病毒病大流行自2019年12月以来，对人类的生活和生计产生了毁灭性的影响。但是，全球科学家和公共卫生机构的令人难以置信的努力导致了紧急使用授权并快速部署基于抗体的对策，包括治疗性单克隆抗体（MABS（MABS）（MABS）），疗养血浆疗法和信使RNA，灭活和病毒载体疫苗。基于抗体的计数测量的成功取决于抗体通过与SARS-COV-2尖峰（S）糖蛋白结合来中和SARS-COV-2感染的能力，该糖蛋白正常结合血管紧张素转化酶2（ACE22））在宿主细胞上以实现细胞进入。通常在中和测定中测量抗体的有效性。但是，该测定需要SARS-COV-2隔离和处理在一个生物安全水平BSL-3练习后3（BSL-3）实验室根据CDC生物安全指南。BSL-3实验室仅限于一些机构，从而限制了评估基于抗体的计数措施成功的范围。一种可行的替代方法是在这些中和测定中使用假病毒代替SARS-COV-2。伪病毒可以在常规的BSL-2实验室中安全处理，这些实验室可广泛使用并大规模使用，开放良好的治疗机会。

假病毒的定义

假病毒是由替代病毒核心组成的合成嵌合体，它来自亲本病毒，并在其表面上的包膜糖蛋白来自异源病毒。¹用于生成假病毒的母病毒通常是色夫病毒（例如，囊泡口腔炎病毒（VSV））或逆转录病毒（例如，鼠白血病病毒（MLV）或人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）（HIV-1）（HIV-1）（HIV-1）（HIV-1））¹。修饰父病毒基因组以删除复制所需的必需基因，包括天然包膜糖蛋白基因，而是插入了用于荧光素酶或荧光蛋白的报告基因。¹因此，假病毒对于进行完整的复制周期而言是有缺陷的，并且只能经历单个感染周期。¹

图1： 表达SARS-COV-2 S糖蛋白的假病毒在宿主细胞的表面上结合ACE2受体，其中TMPRSS2蛋白酶裂解导致病毒和宿主细胞膜的构象变化和融合。融合后，基因组被释放到细胞细胞质中，并表达由基因组编码的报告基因，其活性通过仪器量化。

在成功的假病毒感染的宿主细胞感染后，将表达报告基因荧光素酶或荧光蛋白，可以分别使用发光计或荧光计对其活性进行定量（图1）。由于感染宿主细胞的输入步骤受表面上的包膜糖蛋白的控制，因此，用于假病毒感染的宿主细胞必须表达适当的受体，该受体结合感兴趣的包膜糖蛋白。因此，假病毒是研究与包膜糖蛋白和病毒进入过程有关的功能的出色替代物。介导进入宿主细胞的病毒包膜糖蛋白是免疫系统产生中和病毒进入的抗体的主要靶标之一（图2）。^{1，，，，2}因此，病毒包膜糖蛋白在许多大流行和流行潜力的病毒中对疫苗和mAb发育有兴趣（例如，流感，埃博拉病毒和Covid-19）。

图2：使用表达SARS-COV-2 S糖蛋白的假病毒的中和测定。靶向S糖蛋白的中和抗体预防ACE2受体结合，因此，融合，基因组释放和报告基因表达的随后步骤。

假病毒平台

假病毒在评估动物模型和临床试验中使用的疫苗和mAB的功效方面具有很大的优势。已经开发了基于VSV，MLV和HIV平台的几个SARS-COV-2 S假病毒，目前正在全球使用，以评估基于抗体的对策的成功。

VSV平台

用于使用VSV平台制作假病毒，最初是VSVδG-G*伪病毒必须产生。这是通过转染两个质粒来实现的，一种编码为缺乏天然糖蛋白并包含报告基因基因的VSV核心基因组（VSV）δg），以及其他编码VSV包膜糖蛋白（G*）的编码，可用于转染的HEK293T细胞。³这导致VSV的生产δg-g*假病毒然后可用于感染先前用表达SARS-COV-2 S糖蛋白的质粒转染的HEK293T细胞。VSVδG-G*假病毒基因组包含复制和报告基因所需的所有核心成分，但缺乏伪病毒组装和萌芽所需的包膜糖蛋白。³尖峰糖蛋白在质膜上分别表达δG-S假病毒。VSV的G*的任何结转δ通过添加针对G*的中和抗体，可以防止用于感染的G-G*假病毒。VSVδ然后，G-S假病毒可以直接用于表达ACE2受体（HEK293T-ACE2）的HEK293T细胞或允许S结合和进入的Vero细胞。生产VSV的一般时间表δG-S假病毒为五到六天。³

MLV和HIV平台

MLV和HIV平台采用三种质粒转染HEK293T细胞：

- 编码MLV/HIV核心基因的质粒，插科打诨和pol但是缺乏MLV/HIV信封糖蛋白env基因

- 编码萤火虫荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，ψ-RNA包装信号的转移载体质粒，以及5'-和3'FARKing的长期重复（LTR）区域

- 编码感兴趣的包膜糖蛋白的质粒，在这种情况下为SARS-COV-2 S.

转染两天后，可以收集假病毒并纯化以感染宿主细胞。产生MLV-S/HIV-S假病毒的一般时间表为两天。

伪病毒的优势和局限性

如下所述，与被分类为BSL-3药物的本地病毒相比，假病毒具有几个优点和一些限制。

优点

1。伪病毒易于扩展，遗传稳定且固有地比本地病毒更安全。^{1，，，，4}

2。伪病毒允许研究在细胞培养中无法种植新的新兴病毒和病毒的细胞进入机制。⁴

3。可以通过报告基因来量化宿主细胞的进入过程和目标细胞向量（图1）。¹

4。可以使BSL -3或-4设施（其中有限的可访问性）对细胞进入的细胞进入研究。由于假病毒的复制有缺陷，因此可以在常规的BSL-2设施中安全处理。⁴

5。可以产生表达或缺乏感兴趣基因的稳定细胞系。¹

6。可以产生用于基因输送的病毒载体和疫苗。⁴

7。可以通过量化中和测定中的中和抗体来评估疫苗和治疗性单克隆抗体的功效（图2）。¹

8。可以研究病毒进入抑制剂的治疗潜力。¹

限制

1。 假病毒上的包膜表面糖蛋白密度可能不一定反映天然病毒上的原始密度。

2。 尽管几项研究观察到假病毒和天然病毒中和之间存在显着相关性，但一些研究仍报告它们之间缺乏相关性。⁵

3。 使用HIV平台生成的假病毒不能用于评估抗逆转录病毒疗法（ART）中HIV感染个体基于抗体的反应措施的成功。ART涉及核苷类似物，可能会干扰中和测定中报告基因的逆转录和整合步骤，从而导致误报。¹因此，必须使用基于VSV或MLV的替代平台。

在与SARS-COV-2的战斗中使用伪病毒

Neerukonda等。已经开发了一种基于HIV平台的简便且高效的SARS-COV-2假病毒系统。¹尽管存在几个SARS-COV-2假病毒平台，但Neerukonda开发的系统等。在相对较短的时间内，相对地达到了较高的假病毒感染水平，这允许筛查基于抗体的反应量，以大规模接种疫苗或感染的个体进行筛查。¹出于假病毒感染的目的，他们设计了HEK293T细胞系，该细胞系稳定地表达ACE2受体和TMPRSS2蛋白酶（HEK293T-ACE2/TMPRSS2），该蛋白酶支持与当前可用的任何其他细胞类型相比，该蛋白酶支持较高的伪病毒感染水平。¹这个测定，发表在Plosone中，这是一个重大进步，目前正在全球科学家和公共卫生机构雇用，以快速筛选和测试基于抗体的反对现有和新兴SARS-COV-2变体的反应措施。此外，该系统还可以研究其他具有人类健康重要性的病毒，包括流感，埃博拉病毒和乙型肝炎。

参考

1. Neerukonda，S.N。;Vassell，R。；赫鲁普，r。Liu，s。;Wang，T。;塔克达（K。）Yang，Y。;Lin，T.-L。;Wang，W。;Weiss，C.D。 Establishment of a well-characterized SARS-CoV-2 lentiviral pseudovirus neutralization assay using 293T cells with stable expression of ACE2 and TMPRSS2.PLOS ONE。2021、16，E0248348。doi：10.1371/journal.pone.0248348

2. Nath Neerukonda，S。；Vassell，R。；Weiss，C.D。靶向靶向流感血凝素的保守茎区域的中和抗体。疫苗。2020，8，382。Doi：10.3390/疫苗8030382

3. Zettl，F。;Meister，T.L。；Vollmer，T。；Fischer，b。Steinmann，J。；Krawczyk，A。;V’Kovski，P。;Todt，d。;Steinmann，E。;Pfaender，S。等。 Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes.疫苗。2020，8，386。Doi：10.3390/疫苗8030386

4. Millet，J.K。;惠特克（G.R.）基于鼠白血病病毒（MLV）基于冠状病毒峰值型颗粒的产生和感染。Bio Protoc。2016，6，E2035，doi：10.21769/Bioprotoc.2035

5. Wang，P。;Nair，M.S。;Liu，L。;Iketani，s。;lu。Guo，Y。；Wang，M。；Yu，J。;张，b。Kwong，P.D。等。 Antibody Resistance of SARS-CoV-2 Variants B.1.351 and B.1.1.7.自然。20