细胞和基因疗法有望对现代医学的景观产生重大影响，具有未满足临床需求的一系列不同疾病的潜力。

但是，与之相比目前正在开发。这种疗法翻译的主要障碍是将治疗基因的安全整合到人类基因组中。治疗基因的插入具有“关闭靶”效应的风险，或将基因整合到意外的位置。

A不同策略的数量已经提出了减轻这种效果的建议。最新的工作是来自哈佛大学的WYSS生物学启发工程研究所，，，，哈佛医学院（HMS）和瑞士的Eth Zurich。

出版于细胞报告方法，，，，该研究的重点是识别基因组中的“安全斑点”。这些位置被称为基因组安全港口（GSHS），是符合以下标准的基因组中的区域：可以通过基因组编辑策略轻松访问它们，与具有功能特性的基因和允许表达表达的基因在安全距离之内治疗基因，只有“降落”到港口后。一个简单的类比是决定要停靠船的哪个港口 - 有很多考虑因素，这些因素取决于您航行的船类型，天气条件和易于通道。

研究小组采用了计算策略，从而识别了2,000个预测的GSH。从最初的身份证明，他们成功验证了两个站点两者体外和体内使用报告基因蛋白。

捷克葡萄牙直播采访了研究的第一作者Erik Aznauryan博士，实验室研究员乔治教堂教授在哈佛医学院。Aznauryan进一步详细介绍了GSH研究史，采用的方法来验证GSH站点以及本研究的潜在应用。

莫莉·坎贝尔（MC）：您能谈谈基因组安全港研究的历史，以及如何发现它们？

Erik Aznauryan（EA）：在先前的研究中，经验鉴定了三个基因组位点，以支持人类细胞中感兴趣基因的稳定表达：AAVS1，，，，CCR5和Hrosa26。所有这些示例都是在没有对其居住基因组基因座的任何A-Priori安全评估的情况下建立的。

已经尝试确定可以满足各种安全标准的人类GSH站点，从而避免了现有站点的缺点。Sadelain及其同事开发的一种方法使用了将β-珠蛋白和绿色荧光蛋白基因基因转导为诱导的多能干细胞（IPSC），然后根据其与各种编码和调节元素的线性距离评估整合位点的诱导多能干细胞（IPSC）。基因组，例如癌症基因，miRNA和超保守区域。

他们发现了一个满足所有提议的标准的慢病毒整合部位，证明了IPSC的红细胞分化后可持续的表达。然而，未评估与整合到该站点的转基因细胞的全局转录组谱改变。Weiss及其同事的类似方法在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中使用慢病毒整合来识别支持生物技术应用长期蛋白质表达的位点（例如，重组单克隆抗体的产生）。尽管这项研究导致对CHO细胞中耐用，高级转基因表达的多个位点的评估，但未对人类基因组部位进行外推。

另一项研究旨在通过对MCREI站点的生物信息学搜索来鉴定GSH，这是由I-CREI HOHING HOHING核酸酶的单体版本瞄准的区域，在绿藻中发现并表征了绿色藻类的特征，能够使靶向的交错双链DNA断裂 - 居住在满足GSH标准的位置。像以前的工作一样，在人类中鉴定了几个稳定的表达位点，并提出了用于合成生物学应用。但是，尚未进行集成事件后的局部和全球基因表达分析。

所有这些潜在的GSH站点都具有通过慢病毒或基于MCREI的整合机制缩小的共同局限性。此外，对其中一些确定的站点以及先前建立的安全评估AAVS1，，，，CCR5和Rosa26通过评估仅在这些整合位点附近的基因的差异基因表达来进行，而没有观察到整合后的全局转录组变化。

基于既定标准对GSH站点进行更全面的生物信息学引导和全基因组搜索，然后对各种细胞类型中的转基因表达耐用性进行实验评估，并使用全局转录组分析进行安全评估，因此，将导致更可靠的识别和临床上有用的基因组区域。

MC：如果GSH不编码蛋白质或具有基因表达功能或其他细胞过程的RNA，它们在基因组中的功能是什么？

EA：除了蛋白质编码，功能性RNA编码，人类基因组的调节和结构区域外，其他知识不足和不活跃的DNA区域还存在。

人类基因组的很大一部分似乎在存在各种整合病毒的情况下进化了，这些病毒在百万年内将其DNA插入真核基因组中，导致建立了广泛的非编码元素，我们继续至今。此外，功能性人类基因的部分重复导致形成了非活性假基因，这些假基因占据了基因组中的空间，但尚不知道具有细胞功能。

最后，尚不清楚人类基因组的某些非编码部分的功能作用。我们对安全港口的搜索是使用人类基因组的现有注释进行的，并且随着它的更多组成部分被解密，因此对基因组插入的基因组区域的识别将变得更加了解。

MC：您是否可以讨论为什么以前将基因组的某些地区视为GSH，但现在被认为是非GSH？

EA：在没有其他替代方案的情况下AAVS1，CCR5和Hrosa26该站点在历史上被称为GSH，因为它们支持各种细胞类型中感兴趣的基因的表达，并且适合在研究环境中使用。

它们的警告（主要是在功能基因内含子内，密切包围的其他已知蛋白质编码基因以及癌基因的位置）但是，它们阻止它们用于临床应用。因此，在我们的论文中，我们不称它们为GSH，而是将我们新发现的网站称为GSH。

MC：您彻底扫描了基因组，以识别候选基因座以进一步研究为潜在的GSH。您能否讨论您在这里采用的一些技术方法，为什么？

EA：我们使用几个公开可用的数据库来鉴定根据我们在研究开始时概述的人类基因组结构，调节和编码成分的基因组坐标（外部基因，Oncogenes，lncrnas等）。我们使用这些坐标和生物信息学工具（例如Command Line的BedTools）来排除这些基因组元素以及与之相邻的区域。这给我们留下了基因组区域 - 推定的GSH，然后我们可以通过将报告基因和治疗基因插入其中，然后从中进行实验验证，然后对GSH综合与非整合细胞进行转录组分析。

MC：您将搜索范围缩小到测试五个，然后缩小了两个GSH。在评估细胞系中的两个GSH时，您可以扩展您选择的记者基因吗？

EA：通常，在研究中，您可以使用可用的东西，或者您当前正在工作的实验室最感兴趣的东西。

我们的案件不是例外，我们最初（直到T细胞工作）使用了Mruby记者基因在当时的苏黎世实验室中广泛使用并广泛使用和验证。

当我搬到哈佛大学的Wyss研究所时，我开始与Denitsa Milanova博士，他有兴趣在皮肤基因疗法的背景下测试这些部位，尤其是由连接皮肤不同层的各种锚固蛋白中的突变引起的，尤其是连接表皮溶液的治疗 - 其中包括羊羔3基因。因此，我们决定在人真皮成纤维细胞中表达该基因，并与绿色荧光蛋白一起表达可视化的表达确认。我们希望我们能够将这项研究转化为诊所。

MC：您能描述如何在潜在疗法中使用GSH的示例吗？

EA：当前的细胞疗法方法依赖于将感兴趣基因的随机插入到人类基因组中。这可能与潜在的副作用有关，包括治疗细胞的癌变以及插入基因的最终沉默。

我们希望当前的细胞疗法最终将过渡至治疗基因插入，这将精确地插入我们的GSH，这将减轻两种描述的问题。特定的实施领域可能涉及T细胞进行癌症治疗的更安全的工程：插入靶向肿瘤细胞或能够增强抗肿瘤反应的细胞因子的受体的基因。

此外，这些部位可用于治疗皮肤细胞的工程（如前所述，羊羔3例如）以及抗衰老应用，例如导致年轻皮肤表型的基因表达。

最后，鉴于我们已确定的位点的基因表达的稳健性，它们可用于行业规模的生物制造：高收益在人类细胞系中感兴趣的蛋白质，用于随后的提取和治疗应用（例如，产生凝结因子的生产对于血友病患者）。

MC：此阶段的研究有任何局限性吗？

EA：这项研究的主要局限性是使用基于CRISPR的敲入工具的基因组整合事件的低频。这意味着，在没有这种整合的情况下，必须将成功集成到GSH的感兴趣基因成功地集成到GSH中。

然后，这些分离的细胞将扩展以产生基因构细胞的同质群体。这种管道对于临床环境并不理想，需要改善基因整合效率，以帮助该技术更容易转化为诊所。

我们的实验室目前正在开发基因组工程工具，该工具最终将允许以高精度和效率将大基因集成到GSH中。

MC：这项研究对细胞和基因疗法发育空间有什么影响？

EA：这项研究将有望导致许多领域的研究人员测试我们的站点，在其他治疗相关的细胞类型中验证它们，并最终在研究中以及在诊所中使用它们，作为当前基于病毒的随机基因的更可靠，耐用和安全的替代品插入方法。

此外，由于在我们的工作中，我们分享了我们的计算管道确定的所有推定GSH，因此我们希望研究人员将尝试通过实施我们在论文中概述的GSH评估管道来测试我们尚未验证的网站。这将导致鉴定更多具有更好的临床翻译或生物制造特性的GSH。

MC：推进这项工作的下一步是什么？

我们希望有一天能够翻译我们的成功体外皮肤结果并开始在体内语境。

此外，我们期待提高集成效率到我们的GSH中，这将进一步支持我们站点的临床过渡。

最后，我们将评估GSH对大规模生产治疗相关蛋白的可用性，从而改善生物制造制造的管道。

Erik Aznauryan博士正在与技术网络的高级科学作家Molly Campbell讲话。捷克葡萄牙直播