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COVID-19的大流行已经显示了整个世界的重要病毒研究。事实证明，多年的研究SARS和其他冠状病毒是宝贵的基础，使研究人员能够确定SARS-COV-2尖峰蛋白的结构，并迅速开发挽救无数生命的疫苗。

在许多方面，病毒学领域正在经历文艺复兴时期，在过去十年中，许多基本技术迅速发展。除了全球大流行催化的生长外，对此的重要贡献是低温样品保存和分析的标准化和商业化。在本文中，我们将讨论冷冻电子显微镜（Cryo-EM）在病毒学研究中的整合，以及在生物安全实验室中与有害病毒物种合作所带来的独特挑战。

早期病毒分析

从历史上看，通过化学固定或结晶保存了细胞和病毒样品。如果整个病毒分析是不切实际或不可能的，则将样品分解为​​关键蛋白，以进行深入的结构分析。尽管这些技术为病毒的结构，行为和功能提供了宝贵的见解，但它们与病毒作用的本地环境不同。尽管这对于孤立的成熟病毒颗粒是可以接受的，但它在对病毒 - 细胞相互作用的理解中却有缺口，尤其是一旦病毒被内化到细胞中。

用于病毒复制的细胞机械的重编程是一个复杂且高度瞬态的过程。即使通过化学固定可以进行细胞内成像，捕获这些短暂的事件也是一项挑战，尤其是有足够的细节来否定正在发生的事情。

冷冻电子显微镜

在低温样品制备中，水样标本迅速冷冻，以将其保存在无定形（玻璃体）冰中。与形成随着形成的结晶冰不同，玻璃冰分子通常保留在其液相位置，从而保留样品的周围分子结构。从本质上讲，这在近乎本地的状态下采用了标本的“快照”。

为了进行病毒分析，冷冻保护在一系列电子显微镜技术的发展中发挥了作用，广泛地描述为冷冻EM。其中最常见的是单个粒子分析，其开发人员被授予2017年诺贝尔化学奖。单个粒子分析使用平均值从数百个2D透射电子显微镜（TEM）的样品的图像中产生3D分子结构，并在冰中随机定向。它通常被认为是X射线晶体学的免费，因为它可以很容易地生成蛋白质和复合物结构的结构，这些结构具有挑战性。

虽然单个粒子分析在结构分析的世界中填补了重要的利基市场，但仍在从其生理环境中分离出的碎片系统上进行。幸运的是，这需要原位观察可以通过另一种互补的低温EM技术，冷冻电子层析成像（Cryo-ET）来容纳。

冷冻电子层析成像

在电子断层扫描中，薄薄的样品逐渐倾斜并成像在TEM内。这些图像代表样品的不同横截面，可以将其组合成样品的单个高分辨率3D表示。虽然单个粒子分析依赖于同一目标分子的许多副本来捕获其各种取向，但断层扫描必须利用一个精确的阶段，以可靠地以谨慎的速度倾斜单个样品。

值得注意的是，这意味着可以在整个低温保存的细胞的一部分上进行冷冻-ET。虽然早期的低温ET实验仅限于固有的薄样品（或较厚的样品的薄区域），但各种冷冻粉状技术的出现使“窗户”可以直接切入冷冻细胞中，以凝视其细胞内机械。

对于病毒学，这是一个独特的机会，可以在进入细胞胞质后捕获红手的难以捉摸的病毒。特别是，冷冻-ET已被用来研究细胞内冠状病毒复制的行为。在莱顿大学医学中心领导的合作中研究人员能够可视化病毒诱导的双膜囊泡的形成，这些囊泡用于掩盖病毒RNA复制。这包括可能导致RNA转运的囊泡表面上的孔结构，将其标记为前瞻性药物靶标。

冷冻电子层析成像揭示了脊髓灰质炎病毒复制的新特征。

脊髓灰质炎病毒感染的HELA细胞的断层图3D可视化。空的衣壳：粉红色，充满RNA的衣壳：红色，蛋白质复合物将衣壳绑在膜上：黄色，腔内密度：橙色和与病毒体共包装的密集颗粒：蓝色。图像由Umeå大学Selma Dahmane提供。

生物安全实验室 - 与敌人合作

病原性全病毒和病毒 - 细胞相互作用的冷冻-ET自然引起了研究人员的极大兴趣，因为病毒病原体对全球人类健康构成了明显的危险。

但是，生物安全实验室已经定义了各种病毒样品存在的离散危险水平。在病原体上构成疾病风险的工作需要更高的生物安全遏制设施，除非工作仅限于孤立的蛋白质或灭活样品。为了确保在这些设施中工作的每个人的安全，研究人员必须采取特定的预防措施并遵守特殊协议，包括不同的仪器要求（例如净化水平）。结果，在这些较高的生物安全水平设施中尚未发现高端冷冻EM仪器。

然而，一些实验室在探索致病物种时表现出了令人鼓舞的结果。例如，Umeå大学的卡尔森研究小组已使用冷冻-ET研究脊髓灰质炎病毒作为模型肠病毒。在他们的工作中，他们能够捕获其宿主细胞中病毒的大部分复制周期。他们观察了病毒转化细胞内环境以促进病毒复制的方式。通过可视化这些离散机制，他们还能够看到细胞防御机制和病毒组装之间的相互作用。例如，尽管细胞触发会破坏它们，但自然自噬因素的抑制使该病毒仍能继续复制。这项工作只能归功于Cryo-Et，它开辟了令人兴奋的途径，不仅是在治疗发展方面，而且在我们对宿主病原体相互作用的基本理解中。

“想象一下，从与宿主接触的病毒接触后，一直到细胞结合，一直通过复制和释放。仅仅十年前，这可能被认为是一个幻想的梦，但是我们正在稳步接近对病毒行为的更全面的理解。” - 塞尔玛·达曼（Selma Dahmane） Umeå大学

Cryo-Et为两个已知的结构已经确定的“已知”病毒以及尚未研究的大量病毒打开了新的见解。关于他们的生命周期以及与宿主细胞相互作用的许多问题仍未得到答复。在确定病毒结构本身的旁边，包括冷冻-ET在内的冷冻EM可以仔细观察宿主细胞内的病毒生命周期，例如进入，复制，装配和释放。关于细胞如何反应和捍卫自己免受病毒感染的反应，还有很多要了解的东西。同样，研究药物或候选药物对病毒生命周期和细胞防御的影响可以更好地为我们准备下一种主要病毒。

观点

病毒学有望进入一个新的发现时代，并通过冷冻保护和分析实现了近亲状态的观察。尤其是冷冻电子层析成像，可以提供洞察力，使我们目前对分子结构的了解和细胞相互作用。在更高层的生物安全设施中安装冷冻电子显微镜将使研究更广泛的病毒物种。通过对病毒作用的全面，多尺度的了解，我们可以设计更好，更有针对性，更有效的治疗方法。访问此信息不会没有挑战，但是实验者和仪器开发人员的共同努力肯定会推动我们前进到这一激动人心的未来。

关于作者

亚历克斯·伊利切夫（Alex Ilitchev）是主要科学编辑，材料和结构分析，在Thermo Fisher Scientific。

Kristian Wadel是Thermo Fisher Scientific的材料和结构分析产品营销经理。