有很多原因,您可能需要确定的存在(或缺乏)和尺寸给定的蛋白质在一个样本。检测或疾病进行调查,以确定遗传操作的成功或失败的实验或识别的存在可能会引起过敏蛋白在食品样本。找出你的目标蛋白,你通常会需要区别于背景的很多人一样,其中一些可能相似属性或大小。免疫印迹就是这样一种技术,它提供了这些功能。

在本文中,我们讨论西方的屁股是什么,他们如何执行,他们向我们展示他们如何不同相关技术。

什么是免疫印迹?

免疫印迹,有时被称为蛋白质免疫印迹,是一种基于抗体的技术用于检测存在,大小和大量的样本中的特定蛋白质。该技术是在1979年开发的¹哈利Towbin和他的同事,后来命名为“免疫印迹”由于技术的相似性,南方的印迹。²

短暂、蛋白质水溶液样品由电泳分离。转移到一个适当的膜后,样品探测使用目标特定的抗体。这些抗体可以检测到,大小和绑定蛋白的丰度评价与已知的标准或控制。

免疫印迹协议

图1显示了免疫印迹协议的概述。^3,4

图1: 免疫印迹协议的概述。

免疫印迹凝胶

免疫印迹可以执行之前,必须分离样品中的蛋白质。这通常是通过蛋白质电泳,如钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - PAGE)或本地页面(链接这个蛋白质凝胶SEO文章时写),分离蛋白根据其分子量和电荷。选择特定的分离方法将取决于分析的目的。清廉形象,离心去除任何固体样品,为了负载只有可溶性分数。如果您感兴趣的蛋白质不溶性分数(例如,细胞膜结合蛋白)研究预处理方法解放和溶解。固体将损害的凝胶和您感兴趣的蛋白质可能会留在叠加凝胶。

同样重要的是加载适当的控制样品和尺寸标记的梯子,使解释最后的污点。

加载控制免疫印迹

至关重要,尤其是在比较不同样本之间的蛋白表达,知道有多少样本已经被加载这可能不是明显的污点。例如,当评估一个污点,乐队从一个样本可能会出现明亮的两倍作为另一个示例。这可能意味着有两倍的目标蛋白质样品,或者它可能意味着更多的样品或更集中的样本已经装载在一个车道。运行一个复制的蛋白质凝胶和发展Coomassie污渍⁵可以帮助消除这种不确定性,它将显示总蛋白的数量⁶在每个示例车道,可以透露任何加载不一致。检测之间的无处不在的蛋白质,甚至应该表达你所有的样品,如整个细胞中肌动蛋白和胞质样品,也可以用作加载控制和有助于确保一致的蛋白质样品转移到膜。然而,这种类型的控制问题可以当模型的对比中,“控制”不同的蛋白质表达,如退化模型。^6,7

蛋白质转移(吸水)

蛋白质必须从蛋白质凝胶转移到一个适当的膜(一般硝基或聚乙二烯二氟化物(PVDF))促进抗体探测。许多技术可以用于转移,包括毛细管转移,扩散转移和真空吸水,但到目前为止最常见的由于其速度和效率electroblotting⁸(也称为电洗脱或电泳转移)。蛋白质凝胶是夹在转移膜和电流。蛋白质的凝胶进行,附着在膜紧密。

electroblotting之内,也有多种策略转移,称为湿,半干和干转移。湿转移效率和提供灵活的缓冲,但耗时。半干转移更快,还提供了灵活性,但湿传递效率不及大型蛋白质。干转移高效、快速,但比其他方法提供了更少的灵活性。

传输效率可以评估调查之前使用一个可拆卸的朱红色年代等污渍。

免疫印迹阻塞

由于高亲和力的蛋白质印迹膜,后转移重要的是阻止任何剩余的结合位点,以防止后续试验检测抗体的非特异性结合。这是通过孵化的膜蛋白质的液体,如牛奶或血清。

免疫印迹洗

阻塞后,重要的是洗膜去除多余或每一步之间的试剂。不足或不均匀清洗可能导致质量差/不完整的印迹和高背景。然而,在洗涤可以减少目标信号是非常重要的优化清洗步骤的数量和持续时间。确保膜覆盖着一个适当的缓冲,应用温和搅拌洗膜均匀而不会造成损害。常用缓冲包括tris-buffered盐水(TBS)和磷酸盐(PBS),通常包含的渐变20 (TBST和PBST)。

免疫印迹抗体

虽然可以使用直接检测(单个抗体识别目标和可检测)免疫印迹,更多的一种间接方法(图2)。在这里,一个主要的抗体用于探测膜和绑定任何目标蛋白质。然后,使用二次抗体结合主要抗体检测。正如所有步骤,优化,⁹在这种情况下选择“正确”的抗体和确定最优浓度,是良好的污点的关键。

图2: 直接和间接免疫印迹,使用的例子展示了化学发光检测。

免疫印迹二级抗体

当使用间接检测化验时,二次抗体需要应用洗后释放过剩主要抗体膜。二级抗体应该具体物种的主要抗体(例如,鼠标anti-rabbit如果主要抗体是来自一只兔子),具备必需的共轭选择检测方法。

免疫印迹分析

有多个方法检测和随后的可视化西方墨迹图包括比色、化学发光、荧光和放射性检测,总结在图3中。

图3: 的例子比色、化学发光、放射性和荧光检测使用一种间接方法。

这两个比色和化学发光检测需要结合酶的检测抗体和被认为是非常敏感的技术。辣根过氧化物酶(合)和碱性磷酸酶(美联社)是最常用的酶,与合通常青睐由于其稳定性,顺从大多数结合和低成本。在检测中,添加一个衬底膜,由共轭酶起作用,使化学变化。如果执行比色检测,显色底物选择发生改变,可以可视化和直接成像。然而,提示成像的污点是重要的颜色会褪色吸干。在化学发光检测,¹⁰产生的信号只持续只要酶和底物之间的反应发生(通常是24小时)。在这段时间里,信号可以通过暴露x射线胶片记录或使用数码影像制作永久性记录。

在荧光检测,检测抗体是共轭荧光团,而不是一种酶。当一个特定波长的光照射,他们变得兴奋,释放出不同的特定波长的光。这可以捕获视觉使用数字成像系统,如雪崩光电二极管(adp),光电倍增管(PMT)或电荷耦合器件(CCD)相机。而需要专业设备进行激发和检测步骤,没有衬底一步荧光检测,缩短协议。还可以多路复用荧光团¹¹免疫印迹分析。

放射性检测,放射性同位素是共轭检测抗体和发射的辐射检测x射线胶片,被广泛使用在过去。然而,这项技术需要特殊处理,以保护人员的辐射,是昂贵的,由于放射性衰变寿命有限。因此,这项技术主要被取代的其他可用的检测方法。

免疫印迹剥离缓冲

剥离的过程是消除中小学抗体免疫印迹膜。这可以帮助如果你想调查一个以上的靶蛋白在特定的污点,而不是运行多个墨迹,例如样品极其有价值或者稀缺。

请注意,从膜剥离也可以删除一些蛋白质定量比较之前和之后不能剥离和检查缺乏蛋白质不应剥夺了膜。

PVDF膜¹²建议如果你打算带你的污点,因为他们更善于保持蛋白质比硝基后剥离。比色检测¹³也留下了永久的污点化学发光检测是这个应用程序的支持。

如果可能的话,从轻微的剥离与低pH缓冲地带,减少样品损失和尝试更严格的剥离通过洗涤剂或热如果这是不成功的。

免疫印迹结果和量化

当使用x射线胶片获得结果从你的免疫印迹实验中,常常需要暴露几部电影来优化曝光和显影时间。不够长,样本乐队可能微弱或不可见。太长,背景信号变得太强烈,乐队融合在一起,产生的污点是非常黑暗的,很难解释。控制或标记大小不平衡浓度与目标也可以是有问题的,与前一个已经曝光过度了其他足够清晰可见。电影是数字化使用分析软件为进一步审讯。^14,15

检测方法利用x射线胶片被认为是定性或半定量。比较样本车道控制和乐队的大小标记可以帮助建立一个目标的存在与否在一个样本。然而,如果定量¹⁶是必需的,例如基于摄像头与CCD数码影像设备,提供了一个更好的选择由于其较大的动态范围,更大的敏感性和高分辨率。曝光时间可以调整不需要重复耗时的x射线胶片曝光和发展,优化信噪比。这可以很容易地输入软件可以分析¹⁷和比较数据。

免疫印迹故障排除

有很多机会在免疫印迹协议事情出错,我们突出一些常见问题,并提供可能的解决方案。^18,19

• 乐队在凝胶蛋白质的分离/差定位不足(随后污点)——优化蛋白质凝胶和运行时间百分比来满足您的目标。
• 什么在你的污点,甚至没有梯子——确保印迹工具包放在一起以正确的顺序和当前运行在正确的方向上否则你的样品会吸到缓冲区。
• 污点出现混乱/参差不齐——确保没有气泡保持凝胶和膜之间设置转移。确保膜完全淹没,轻轻混合在孵化和清洗步骤创建一个更的结果。使用新鲜的阻断剂。
• 高的背景——阻塞或洗涤可能是不够的。
• 控制样品的结果与预期结果不一致——优化抗体选择/浓度减少非特异性/非目标绑定。检查你的实验假设和概念。你的期望是不正确的?
• 乐队是很难看到最后的污点(太黑暗或光明)在检测阶段——优化发展中倍增加或减少信号强度。如果乐队显得太轻,这也可能表明过度清洗。优化抗体浓度和考虑你选择的抗体也可以帮助。
  
  

印迹和免疫印迹

而设计了免疫印迹检测特定的蛋白质,南部的一个污点,²开发于1975年,其发明者的名字命名的埃德温南部,^20.用于检测特定DNA序列。与免疫印迹,样品的电泳分离和转移到膜。然而,该地区与序列互补的DNA片段,然后使用您希望检测探头检测前膜。

北方的污点和免疫印迹

北部的印迹,²开发1977年由詹姆斯•Alwine戴维•坎普和乔治·斯塔克²¹用于检测特定的信使rna序列。北部与西部和南部印迹、样品进行吸去通过电泳分离和转移到膜。互补脱氧核糖核酸片段的序列,然后使用免费的地区利益作为探针检测之前。

免疫印迹和sds - page

sds - page是一项用于分离蛋白质电泳技术根据他们的分子质量,而整个过程需要免疫印迹检测特定蛋白的存在。sds - page通常是电泳技术选择在免疫印迹协议来分离出所有的蛋白质内吸掉前一个示例。

免疫印迹的目的

原因有很多检测存在,大小和大量的目标蛋白质在一个示例可能是可取的,这些原因可以跨多种学科。的存在与否以及目标,技术可以评价:²²

• Protein-DNA交互-附件的DNA结合蛋白质特定DNA序列是至关重要的转录调控的过程。西南部的印迹²³(类似于免疫印迹膜;探讨了DNA除外)可以用来识别转录因子²⁴在基因调控的研究中。
  
  
• 蛋白质相互作用——这些是至关重要的许多重要的细胞过程。检测蛋白质-蛋白质之间的关系,用免疫印迹称为的一种变体偏远的印迹,^25,26有助于阐明细胞功能和功能障碍。
  
  
• 转录后修饰(铝)——多功能天车蛋白质折叠,因此函数的影响,扩大蛋白质组多样性。然而,异常的天车的一直与疾病有关。因此,他们的研究是研究者极大的兴趣和免疫印迹提供了一个这样的工具。
  
  
• 检测蛋白质对碘氧基苯甲醚——蛋白质可能在不同的细胞中表达不同的亚型不同活动或目标。或者,他们可能需要分裂成为激活。
  
  
• 抗体特征——当抗体生产工具或疗法,他们验证和鉴定²⁷确保正确的性能和安全至关重要。作为一个基于抗体的方法,西方墨点法是一种有用的技术在这一过程中。
  
  
• 抗原决定基映射——了解和抗体结合的靶蛋白是有价值的研究,诊断和治疗的目的。朝着这个目标有许多工具,由于其特异性免疫印迹²⁸就是其中之一。
  
  
• 蛋白质亚细胞定位——执行免疫印迹分析不同的细胞分数允许目标蛋白质在细胞的位置确定。单细胞蛋白免疫印迹^29日在这个领域提供了伟大的见解和克服一些抗体大问题其他单细胞化验。

下面讨论一些常见的应用程序。

确定一种表达的蛋白质

评估中可以告诉你如果生物体基因组数据的问题潜在的产生特定的蛋白质。观察转录组会告诉你如果基因打开,但直到你可以探测到蛋白质你可以告诉如果积极表达。^30.当执行实验基因操纵这可能非常有助于确定在基因组层面所作的更改会反映在预期在蛋白水平的变化^31日(例如,一个新颖的蛋白质的表达,截断或损失的表达与野生型菌株相比,表达预期的组织或位置吗?)。

检测标记蛋白

在执行遗传操作,可以工程师和添加标签,如他和GST-tag。³²这些使他们附加的蛋白质容易找到³³在物种或系统被研究样本,提供信息中的蛋白质的位置和命运的问题。例如,是细胞膜的膜蛋白裂解在特定条件下。这也可以检查实验生产重组蛋白时有用。³⁴

映射之间的变化随着时间的推移或组

西方墨点法准时课程实验样品可以提供蛋白质水平变化的信息随着时间的推移,例如在不同细胞周期阶段。同样,当比较不同疾病或治疗组样本,它可以突出在蛋白质水平变化表明这可能是一种疾病的根本原因或影响治疗效果。

总体而言,西方墨点法不被认为是一个特别定量PCR技术比较喜欢。然而,它提供的蛋白质的直接检测意味着它发现确认疾病诊断的实用程序。

非传染性疾病的生物标记物

不同亚型蛋白可以作为生物标记的病理过程,例如癌症。³⁵自身抗体,表明自身免疫性疾病,也可以检测到。而质谱分析通常用于检测,基于抗体的免疫印迹技术仍然是用来证实³⁶高通量方法的研究结果。

传染性疾病诊断

免疫印迹被用来确认等疾病的病例人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒),³⁷莱姆病,^38,39牛海绵状脑病(疯牛病)⁴⁰和曲霉病。⁴¹然而,耗时等技术聚合酶链反应,取而代之的是替代病例数包括化验艾滋病毒测试。

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