细胞疗法的发展正在追求希望的治疗范围广泛的条件和棘手的疾病。质量控制(QC)技术和协议需要支持免疫疗法和再生医学的发展。开发适当的监管标准细胞治疗产品的质量控制是至关重要的保护病人接受这种治疗,和保护。例如,无证和自称为“干细胞诊所”给患者造成严重的负面影响;报道一个案例中,患者的印象他们参加临床试验,但支付来获得双边intravitreal注射导致视力丧失。1这些情况下也可以损害合法的干细胞研究的声誉。
就像一个个性化的方法是用来治疗病人,可能是没有“一刀切”的评估质量控制程序细胞疗法制造业。
鼓励行业达成协议“质量”是什么意思,全球iPSC联盟(诱导多能干细胞)疗法(步态)成员调查他们如何理解上下文中的关键质量属性clinical-grade iPSC线作为同种异体治疗发展的起始物料。这些都是万能的关键质量属性:2
● 身份(真实的基因型和表现型最初描述)
● 微生物不育(支原体、细菌学和病毒测试)
● 内毒素
● 遗传的忠诚和稳定
● 生存能力
● 描述
●
效力
众说纷纭的精确参数,分析,和标准应该应用于评估上面的列表,但专家同意一件事:整体质量控制策略,不仅要依靠成品测试。相反,它应该包含整个制造过程。
在这个列表中,我们探索的一些最新关键技术在细胞疗法QC旨在解决上述属性。
1)测试评估起始物料
细胞治疗的安全性和有效性的产品高度依赖他们的起始物料的质量。在理想的情况下,会有一个国际公认的“标准”,什么是“临床级”iPSC线。为了达到这个目标,关键质量属性的行业必须同意考虑许多因素,包括身份、稳定性、可行性、效力和不育。这些可能会补充现有的标准与主细胞银行相关化验。对起始物料质量控制检测的例子包括:
核型分析
核型分析,或“核型分析”是所有染色体配对和排序的过程,用于评估多能干细胞是否积累了所驱使的突变。总可以观察到基因变化,以及更微妙的变化包括删除、复制、易位或倒置。3
多能性的测试
我们如何确保万能实际上是多能呢?多能干细胞分化成细胞是由他们的能力从任何的三个胚芽层,所以执行差异化测试是一种方法。多能性标记可以用于预测与功能多能性细胞,用于流式细胞术和免疫组织化学。验证分析模板需要流式细胞术,流阈值标记涉及一些主观性。2、4
短串联重复序列分析
短串联重复序列(STR)基因分型的细胞是用来评估特定的重复片段的DNA,一般两到六个碱基对长度 str 。STR pcr可用于区分DNA样本和程序验证的细胞和组织。它应该是由一个认可的实验室使用商用设备。2
2)单细胞转录组
下一代测序(上天)大幅先进我们理解不同的病理和疾病风险,同时启用新的诊断功能。然而,随着深入的转录组分析需要大量的细胞的分析,传统的大部分人口测序只提供的平均表达信号的一群细胞。5从一个特定的细胞组织不一定是均匀的,重要的细胞间变异性可能错过了。
单细胞转录组来改变, 见过 的细胞疗法QC的最有前途的新兴技术。细胞疗法行业的主要优先事项之一是识别基因和通路定义细胞状态的差异,以及单细胞转录组可以帮助实现这一目标,使研究人员能够:5、6
● 识别标记细胞的面板制造期间监视和控制
● 跟踪不同的细胞谱系的轨迹发展
● 发现监管基因之间的关系
● 细胞和研究他们的聚类进行分类
●
识别罕见的细胞群
单细胞RNA序列(sc-RNA-seq)协议允许成千上万的单个细胞的转录形象特征,7以及对DNA甲基化的研究,8组蛋白修饰9和染色质可访问性。9scRNA-seq技术不同的细胞分离和标记,但通常工作在相同的一般过程;细胞分离、细胞溶解和RNA是使用独特的编码反转录成cDNA纳米颗粒。两样东西合成后,cDNA通过聚合酶链反应扩增,然后使用门店测序。5通过跟踪唯一编码纳米颗粒,研究人员可以跟踪记录来自细胞。
3)定量软件来分析活细胞成像数据
多能干细胞是著名的为他们的潜在的分化成不同的细胞类型,和他们的许多可能的在再生医学中的应用。多能干细胞,包括万能干细胞和胚胎干细胞,而他们倾向分化成特定的血统。10因此,选择过程是必要的,以确保高的多能干细胞多能性的用于再生医学。
理想情况下,选择过程会便宜,快速和相对轻松。虽然一系列的技术可能会被用来识别所需的细胞,第一个停止的QC火车可能活细胞成像。与 细胞显微技术的主要进步 科学家现在可以想象细胞器,地图染色体位点和机械力量的运动。
尽管活细胞成像的巨大能力允许,决定如何管理和使用数据生成的另一个挑战。开发算法,让科学家自信决策质量控制过程中是一个主要的优先考虑的领域。最近的一篇论文科学报告描述了成像系统的发展使定量评估的程度的体细胞重编程和多能干细胞分化。11通过一代”阶段分配”指数,多能干细胞可以分为殖民地多能性,高或低的方式既非侵入性的和公正的。
4)工具来评估致瘤性
人类胚胎细胞被比作“双刃剑”;的特征使他们能够自我更新和分化成三个生殖细胞层也让他们肿瘤发生的。12免疫缺陷小鼠注入时,人类胚胎干细胞形成良性的生殖细胞肿瘤,称为畸胎瘤。13虽然他们并不相同,人类则也分享他们的致瘤的特征。12这是一个关键的安全障碍,未分化的多能干细胞坚持最终产品可以开始移植病人的肿瘤发展。4其他因素如细胞转换或基因组不稳定性也可以导致致瘤性。
因此,需要工具来评估致瘤的细胞疗法的潜力。尽管越来越多的细胞疗法产品进入临床试验,目前还没有全球共识的最佳方法,致瘤性评估。14根据这一点,健康和环境科学研究所(HESI非盈利机构)建立了一个委员会来生成基于科学证据需要达成共识的战略评估致肿瘤性(CT-TRACS:细胞Therapy-TRAcking,循环,和安全)。
2019年,CT-TRACS委员会发表了一份意见书Cytotherapy突出显示当前可用方法的局限性和可能的未来的发展方向。4他们指出:
● 致瘤性测试理论指的是检测的最终产品中残留的未分化的细胞或转化细胞,两者都被视为“污染物”或“杂质”最后分化细胞治疗产品
● 由于细胞治疗的复杂性,可能的致瘤性测试套件将为单个细胞在个案基础上开发的产品
●
从细胞致肿瘤性细胞致瘤性是不同的
目前可用的技术
体内试验
一些免疫功能不全的动物模型提供了机会在活的有机体内致瘤性评估,提供证明移植和移植细胞的生存产品可以成功了。4就像在体外测试,没有全球共识表明,细胞所需的参数不太可能形成肿瘤。
在体外 测试:
下表中列出的方法可以用来检测致瘤性的不同方面:4
方法 |
用于检测 |
流式细胞术定量rt - PCR,液滴数码PCR、高效多能干细胞的文化,发现标记分子的释放到培养基 |
多能干细胞 |
细胞增殖实验 |
永生化细胞 |
数字软琼脂集落形成试验 |
Anchorage-independent细胞生长 |
核型分析、阵列比较基因组杂交的荧光原位杂交,上天 |
基因组不稳定性 |
新兴技术:Organ-on-a-chip
Organ-on-a-chip技术可以用来模拟组织移植到patient-derived细胞和确定肿瘤的发展。15虽然这种方法是在开发的早期阶段,一些概念验证研究表明其潜力。
5)不育性测试
与一些生物制药产品,细胞疗法产品不能完成最后一个无菌过滤步骤。此外,产品保质期有限的细胞疗法产品带来了额外的挑战。这将创建一个需要快速微生物方法,确保污染物在制造过程中被删除。存在一系列的测试,确定支原体、细菌和病毒,快速qPCR显示特定的承诺。去年,快速qPCR测试支原体被美国食品和药物管理局批准,健康加拿大和欧洲药品局CAR-T产品在临床使用 研究。16
建立细胞疗法QC要求行业协议达成共识的标准化参数和分析。理解特定突变的影响,通过数量和其他因素将帮助引导行业走向最合适的技术和质量参数。
引用:
2。 沙利文年代,斯泰西GN, Akazawa C,等。质量控制指南clinical-grade人类诱导多能干细胞系。地中海的回复。2018;13 (7):859 - 866。doi:10.2217 / rme - 2018 - 0095
3所示。 奥康纳,c(2008)染色体异常核型分析。自然教育1 (1):27
4所示。佐藤Y,也免不了H, Di广场M, et al .致瘤性细胞疗法的评估产品:全球共识和点考虑的必要性。Cytotherapy。2019;21 (11):1095 - 1111。doi:10.1016 / j.jcyt.2019.10.001
5。黄B,李JH,爆炸d单细胞核糖核酸测序技术和生物信息学管道。地中海Exp摩尔。50 2018;(8):1 - 14。doi:10.1038 / s12276 - 018 - 0071 - 8
6。瓦格纳,Regev,约瑟夫·n与单细胞基因组学揭示细胞身份的向量。生物科技Nat》。2016年,34 (11):1145 - 1160。doi:10.1038 / nbt.3711
7所示。AlJanahi AA, Danielsen M,邓巴CE。介绍单细胞RNA-Sequencing的分析数据。摩尔其他方法开发。2018;10:189 - 196。doi:10.1016 / j.omtm.2018.07.003
8。Karemaker ID, Vermeulen m .单细胞DNA甲基化分析:技术和生物应用。生物科技趋势》。2018年,36 (9):952 - 965。doi:10.1016 / j.tibtech.2018.04.002
9。Ku西城中村K,高W, et al .单细胞染色质组蛋白的化学修饰immunocleavage测序(scChIC-seq)配置文件。Nat方法。2019;16 (4):323 - 325。doi:10.1038 / s41592 - 019 - 0361 - 7
10。卡隆Osafune K, L,尹浩然,Borowiak。分化倾向之间的显著区别人类胚胎干细胞系。生物科技Nat》。2008年,26 (3):313 - 315。doi:10.1038 / nbt1383
11。 Nishimura K, Ishiwata H, Sakuragi Y, Hayashi Y,福田,Hisatake K Live-cell亚细胞结构的成像定量评价的多能干细胞。Sci代表。2019;9 (1):1777。doi:10.1038 / s41598 - 018 - 37779 - x
12。 Ben-David U, Benvenisty n .人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的致瘤性。Nat牧师癌症。2011;11 (4):268 - 277。doi:10.1038 / nrc3034
13。 吴Kooreman NG, JC。致瘤性的多能干细胞:生物见解从分子成像。J R Soc接口。2010;7 5 6:s753 - 763。doi:10.1098 / rsif.2010.0353.focus
14。 Z S de王尔德Hj G,毫升、P m基因和细胞治疗的临床开发:欧洲景观的概述。摩尔其他方法开发。2016;3:16073 - 16073。doi:10.1038 / mtm.2016.73
15。 骑士D, Kaushik年代,Correlo VM,奥利维拉JM, Reis RL,茶室SC。Organ-on-chip模型未来个性化医疗的癌症转移:从芯片到病人。生物材料。2017;149:98 - 115。doi:10.1016 / j.biomaterials.2017.10.005
16。卡伦Dreolini L, M,荣智健E, et al。快速和敏感支原体核酸扩增技术筛选的细胞治疗产品。分子治疗方法,临床开发。2020;17:393 - 399。doi:10.1016 / j.omtm.2020.01.009
