什么是液相色谱？

液相色谱（LC）是一种色谱技术，用于分离和分析溶液中化学成分的混合物，以确定是否存在或不存在特定成分，如果存在，则其中有多少。我们中的许多人都会熟悉上学时代的一种平面液晶，在滤纸上制成黑色墨水标记，将末端浸入水中， 观看墨水中的组件颜色分开为 水吸收了纸。但是，分析应用中使用的大多数LC是基于色谱柱色谱法，这将是本文的重点。顾名思义，高性能液相色谱法（HPLC）是用于高效率分离的高性能变体，并具有高色谱分辨率。使用分数收集器，也可以将分离的组件作为纯化后隔离。HPLC有各种不同的构型，用于分离分子量的溶解成分，这些分子量从半挥发性小分子到数千千万尔顿的大蛋白生物分子的分子量。液相色谱法是一种非常流行的分析技术，用于许多应用，从化学工业中的环境监测，粮食安全和质量控制，直到包括新生儿筛查在内的临床诊断。

液相色谱如何工作？

各种不同的系统配置可用于液相色谱仪，效率最高的分离正在运行超高性能液相色谱（UHPLC）仪器，该技术于2004年首次商业化，称为超性能液相色谱（UPLC）。In short, a multi-component mixture that is soluble in the liquid mobile phase is separated due to the individual components’ unique partitioning between the mobile phase (Figure 1 (1)) and the stationary phase (column) (Figure 1 (3)).

流动相（通常是溶剂）用于借助高压泵将样品通过系统运输（图1（1））。但是，它在分离过程中也起着至关重要的作用。

将少量的样品（1-100 µL）加载到样品环中（图1（2）），然后通过六端口阀注入流动相流中，这将触发色谱的开始跑步。注入样品后，将流动相泵入列（图1（3））。提供各种列长度（30至250毫米）和内径（1至4.6毫米），并配有不同活动的固定相吸附物材料和粒径（1.5至10微米直径），共同定义了柱效率和柱子的效率和选择性。该列位于柱烤箱中；在较高的温度（45ºC）下，流动相的粘度会降低其线性速度。反过来，这减少了运行时间，还可以改善色谱分辨率。

混合物中对流动相具有较高亲和力的组件将迅速通过列迁移，而与固定相几乎没有相互作用。当组件叶或洗脱液的带中，检测器（图1（4））将产生与分量浓度成正比的响应。注射和检测之间花费的时间称为保留时间。组件的保留时间对于给定的一组色谱条件将非常具体，并且可以与识别标准的保留时间进行比较。

在相反的相色谱法的情况下，较少的极性分析物将优先分配到非极性固定相中，并具有更长的保留时间。数据采集​​系统（图1（5））记录了检测器响应是色谱图中保留时间的函数。在色谱图中记录的峰（图2）通常集成以确定与样品中存在的分量浓度成正比的峰面积。

图1： 简化的液相色谱仪连字符到质谱仪（LC-MS）的图表：（1）流动相的二进制泵，（2）AutoSampler 6端口阀和喷油器环，（3）带有列的圆柱加热器（4）（4）质谱仪检测器，（5）PC。学分：Anthias Consulting。

自动采样器将样品注入流动阶段后，分离过程将在列中进行。色谱系统的选择性对色谱分辨率具有最大的影响，应针对正在研究的应用和组件量身定制。可以通过更改流动相（不同溶剂）或固定相（更改列类型）中存在的特定化学官能团的偏见强度来改变选择性。

图2 ：来自HPLC或LC-MS的色谱图输出。学分：Anthias咨询

考虑到流动阶段，运行液相色谱仪时，有两种主要操作模式可供选择。同位方法将在色谱运行持续时间内使用相同的流动相组成，而选择性没有变化。梯度方法将使流动相位组合物作为时间的函数进行更改，通常对其进行优化以增加色谱分辨率或缩短运行时间。

固定在色谱柱中的固定相的化学反应会影响技术的选择性。反向阶段HPLC或UHPLC¹是最受欢迎的系统配置，并采用非极性固定相，例如八甲基硅烷（ODS或C18）和极性流动相（水/甲醇）。其他相反的相位固定相包括八叶烷（C8），其疏水性比C18少，对于较小的极性分析物而言，保留时间较短。如果使用了用酚类取代基官能化的色谱柱，则由于其亲密关系的增加，这将增加酚类成分的保留；喜欢吸引。

流动阶段的pH值对离子成分的保留时间产生了深远的影响，应在方法开发过程中利用这一点。缓冲区²可用于维护P下方的两个单元的流动阶段的pH值k离子成分的a又将其解离平衡转移到中性形式。组件的中性形式将较小，因此可以控制其保留时间。

正常相色谱法是另一种LC方法，它根据其极性分离分析物，实际上是在引入反向相液相色谱学之前开发的，但不太流行。固定相在正常相色谱中是极性的³流动阶段是非极性的。这改变了系统的保留特性，混合物的非极性成分首先以最短的保留时间洗脱。极性分析物将对固定阶段具有更高的亲和力，并以更长的保留时间洗脱。还有其他类型的液相色谱法，包括离子色谱，离子对，尺寸排除，亲和力，列表还在继续。除了大小排除色谱法（根据其大小/形状或分子量的分析物分离）外，其他形式的LC提到所有形式都采用了不同的移动和固定相化学。对于要分开的给定组件的选择性和色谱分辨率可实现，由所采用的固定相和移动相位。

一旦分离，这些组件就需要检测。选择探测器由应用程序目标驱动；有多种选择，具有不同程度的灵敏度，特异性，选择性和线性动态范围。最受欢迎的检测器是紫外线可见（UV-VIS）检测器，该检测器测量特定波长下的光吸光度。基于要分析的组件的lambda最大选择波长，检测器响应与该特定分量的浓度成正比。当组件从色谱柱上洗脱时，其在检测器流动池中的浓度将上升和下降，而这又将其绘制为色谱峰（见图2）。数据采集​​率应设置为在整个峰值上至少获取20个数据点。与如此多的色谱技术一样，质谱系统的连字符通常提供最佳的分析分辨率，并提供各种可用的选项。

用于互连LC系统的各个组件的管道的长度和内径至关重要，应将其保持至绝对最小值。从注射环的开始到检测器流动池的末端，色谱系统的任何部分都不是固定相并不促进有效的分离。系统内的额外体积称为空隙体积，空隙内分离成分的额外纵向扩散将导致敏感性丧失和色谱分辨率降低。

UHPLC从HPLC的演变

UHPLC的演变部分是由于分析师对越来越复杂和具有挑战性的样本的更高分辨率分离的不断增长的要求所驱动的。使这一步骤变化的主要突破是色谱性能的变化是开发亚2微米固定相包装材料⁴具有狭窄的粒径分布。

新颗粒的制造具有与常见的HPLC固定相相同的化学功能，该相确保了使用相同的流动相时保持色谱系统的选择性。使用新的Sub 2微米包装材料时，可提高的效率或板数实现了显着的性能优势。

将HPLC方法迁移到UHPLC系统（包括较短的运行时间，更高的色谱分辨率，提高灵敏度和较少溶剂消耗）时，有许多优势可以看到。为了使用新型的UHPLC列，有必要使用可以在较高压力下运行的泵，以适应柱中较小颗粒所施加的增加的背压。探测器流动池还需要升级必须具有较小的内部体积，这是检测柱从柱上洗脱的组件的较窄带。还需要相应提高数据采集率，以确保整个峰值的足够数据点。

质谱与液相色谱（LC-MS）的连字符

质谱法可以说是最佳检测器，当使用具有很高质量分辨能力的仪器时，由于其高灵敏度，线性动态范围，选择性甚至特异性，可以与液相色谱仪连同液相色谱仪。质谱技术用于确定质量与电荷比（m/z）组件或分析物。与气相色谱 - 质谱法（GC-MS）不同，LC系统与MS的连字符并不容易，并且花了很多年的时间才能开发。电喷雾电离（ESI）是当今LC-MS中使用的最常见的电离技术，该技术在大气压下发生电离过程。很难实现的大气压力入口开发到质谱系统中所需的高真空。

您如何阅读LC-MS质谱，它告诉您什么？

电喷雾电离是一种非常柔软的电离技术，这意味着在离子形成过程中几乎没有观察到的碎片。LC-MS系统可以以一种阳性离子模式运行，用于生成质子分子的基本分析物[M+H]⁺，或用于产生去质子化分子的酸性分析物的负离子模式[M-H]^-。

有可能碎片离子由电喷雾过程通常通过碰撞引起的解离（CID）生成，以获取更多信息以表征或鉴定目标分析物。CID可以通过更改应用于第一个采样或脱脂机锥的电势差，或在离子加速到抗激气中加速离子等碰撞电池中的电位差来执行CID。

图3代表了一个完整的扫描LC-MS采集，其中包含源碰撞诱导的解离，为混合物的每个分离成分产生一系列特征片段离子。沿X轴绘制质量与电荷比（M/Z），并沿Y轴绘制离子的强度或相对丰度。图3上的Z轴代表分离成分的保留时间，每次通过质谱仪一均分析了每个基线分辨色谱峰，可以使用关键的诊断片段离子进行识别和靶离子确认。

图3： MS增加了一系列完整的扫描LC-MS质谱，增加了信息的附加维度。学分：Anthias Consulting。

将液相色谱分为多个尺寸

在处理复杂的多组分混合物时，由于单个峰从列排出。方法开发和优化只有由于缺乏选择性而无法获得色谱分辨率，因此只能使您走得太远，那么可能有必要使用具有替代选择性的附加色谱列来单独的共同洗脱组件。

多维色谱⁵可以通过“心脏切割”转移到具有更合适的选择性的替代色谱柱上，可以将共同阐述的组件转移到单个洗脱组件中。可以使用一个转移阀设置系统，该转移阀仅将第一个维度或列中的共同解剖峰转移到第二维中，以进行后续分离和检测，并以较高的色谱分辨率进行检测。

半准确液相色谱法进行纯化

通过扩大液相色谱系统的尺寸，使用较大的内径以较高流速运行的列，可以将更多材料加载到列上。半足够的色谱法⁶系统可以装有100毫克样品。然后，将分数收集器用于将色谱峰在单独的小瓶中收集到圆柱上。分数收集器是由检测器触发的，该检测器在色谱基线中寻找拐点，表明峰的开始，分离的组件的峰作为纯部分收集。然后，可以对分离的馏分进行补充质谱法（例如核磁共振）（NMR）的其他分析技术，以充分表征结构阐明的化合物。

液相色谱的优势和局限性

LC通常用于多种应用范围；但是，它不适用于挥发性化合物的分离和分析。只有在所有要分离的组件都比流动相的蒸气压力较低时，才能实现强大的分析LC方法。气相色谱法非常适合分析挥发性化合物。

提供了大量不同的柱和溶剂，可提供广泛的选择性范围，从而使组件能够分开具有广泛的极性。大小分子同样适合这种技术。在相对较低的温度下进行有效分离的能力也使LC成为可能在气相色谱中分解的热不稳定化合物的理想分离技术。

液相色谱的常见问题

样本准备是成功的关键。所有样品在将它们加载到自动采样器中之前都要过滤所有样品非常重要。当使用UHPLC工作时，这一点尤其重要，其中使用列中的子2微米颗粒高效率分离，如果未过滤样品，则容易阻止。移动阶段也是如此，尤其是在使用缓冲区时。

对样品的正确注入或稀释剂的使用至关重要，溶剂强度应与流动相的起始条件相同或少。如果使用过强的溶剂，则将观察到峰分裂和差的可重复性。如果在自动采样器中使用了清洗溶剂，可能会观察到类似的问题。

在保留时间的获得色谱图或可重复性差的基线中的波动很可能是由于泵的问题（图1（1））或真空吸尘器引起的。如果泵或真空脱水器无法很好地维护，则止回阀可能会被部分卡住，从而导致压力波纹。可以通过根据制造商指南执行预防性维护任务来解决这些问题，以防止不定期的停机时间和性能差。

参考

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