简单的物理定律规定，当电流应用于包含带电物种的培养基时，这些物种将朝相反的电荷迁移。根据它们移动的介质，其他特征（例如存在的物种的大小）可能会影响其运动，从而导致分离。这是建立电泳技术（例如琼脂糖凝胶电泳）的基础 - 在整个生命科学中广泛使用的技术。

在本文中，我们将考虑琼脂糖凝胶电泳的工作原理，如何解释以及其某些目的。

什么是电泳？

电泳是一种使用电流根据其物理特性（例如大小和电荷）分离DNA，RNA或蛋白质的技术。

什么是琼脂糖凝胶电泳？

琼脂糖凝胶电泳是一种基于核酸（DNA或RNA）片段分离的电泳形式。当施加电流时，带负电荷的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔迁移到凝胶的正带端，较小的片段迁移速度更快。然后，可以使用紫外线（UV）灯可视化所得的带。

RNA，，¹但是，倾向于形成二级结构 - 有时会影响相同片段的多个不同的物种 - 影响其迁移方式。因此，观察到的频带并不总是代表其真实大小，图像是模糊的。因此，天然琼脂糖凝胶（条件不会破坏分析物的自然结构），但往往不用于分析RNA大小，尽管它们可以给出数量和完整性的估计。替代方案包括北印迹和变性琼脂糖凝胶电泳²这种情况使用能够破坏二级结构的条件。

琼脂糖凝胶也可用于分离蛋白质³基于它们的大小和电荷（与DNA/RNA不同，蛋白质根据氨基酸掺入而变化）。但是，由于琼脂糖凝胶中的孔径很大，蛋白质通常在polyacrylamide gelsthat have smaller pores instead, offering greater resolution for small protein molecules.

因此，在本文的其余部分中，我们将重点关注DNA琼脂糖凝胶电泳。

凝胶电泳如何工作？

Agarose是琼脂的组成部分。它形成一个由氢键持有的超螺旋束的螺旋琼脂糖分子的3D凝胶基质，并带有分子能够通过的通道和孔。加热时，这些氢键断裂，将琼脂糖转换为液体，并在重置之前将其倒入模具中（图1）。

图1： 琼脂糖凝胶中的孔形成和温度诱导的状态过渡。

这琼脂糖的百分比包含在凝胶中会影响孔径，从而影响孔的大小，从而可以通过它们这样做的分子大小和速度。琼脂糖的百分比越高，孔径越小，因此分子能够通过，迁移较慢。在分子生物学实验室中，通常使用0.7-1％琼脂糖凝胶用于日常DNA分离，可提供0.2-10 kb范围内的良好，明显的片段分化。较大的片段可以使用较低的百分比凝胶解决，但是它们变得非常脆弱且难以处理，而较高百分比的凝胶可以更好地分辨出小片段，但易碎了，可能会不均匀。

由于DNA对肉眼看不到溴化乙锭（ETBR）在环境过程中掺入凝胶中。这结合了紫外线下的DNA和荧光，从而使DNA片段可视化。存在的DNA越多，乐队越明亮。

与载荷染料混合的样品放在凝胶的一端，该凝胶沉浸在运行缓冲液中。然后，电流通过凝胶缸每端的电极通过凝胶（图2）。

图2： 琼脂糖凝胶电泳设置的插图。琼脂糖凝胶位于缓冲液中，将带负荷染料的样品放在凝胶一端的井中，并施加电流，导致带负电荷的DNA朝着正极电极（阴极）移动。

当样品运行得足够远以获得足够的分离时，将凝胶从水箱中取出并放在紫外线盒上。然后，与具有已知带尺寸的DNA梯子相比，插入染料允许可视化样品带并确定其大小。非线性迁移距离和碎片大小之间的关系，增加了将大小标记作为指导的重要性（图3）。

图3： a）上面的说明描述了DNA电泳的典型结果。在左侧，有一个大小标记，用作样品DNA片段长度（以碱基对）的长度的参考。标记的右侧是三个样本：样品A，样品B和样品C。图像显示了小于较大的DNA片段，小dna片段如何通过琼脂糖凝胶移动。b）图像右侧的图显示了非线性，DNA片段的大小与距离迁移的距离之间的关系。这是一个负曲线，随着DNA片段变大，它们通过凝胶迁移的距离较小。图片来源：麦肯锡埃洛尔（McKenzielower），在Creative Commons归因共享4.0国际执照。

DNA凝胶电泳步骤，凝胶电泳机，电泳缓冲液和电分离

有许多关键步骤⁴参与我们现在将考虑的选择，建立，运行和分析琼脂糖凝胶。

1。Determine the required gel percentage- 0.7-1％琼脂糖凝胶通常足以适合大多数应用，但是选择适合您的样品和预期片段尺寸的百分比很重要。将琼脂糖粉与相同缓冲类型用于运行凝胶并加热以融化混合物，避免沸腾。三乙酸酯 - 乙二胺二乙酸（EDTA）（TAE）或Tris-Borate-EDTA（TBE）⁵通常是首选的缓冲区去质子化并溶于水。EDTA，螯合剂，使可能损害分析的DNA的核酸酶失活。

2。Pour a gel-Choose a gel casting mold and comb of the desired size, giving a sufficient number of wells for all samples and ladders and well capacity to hold the quantity of each sample to be loaded. Secure the open ends of the mold with a casting frame or tape to contain the gel while it sets. Add DNAintercalating dyeinto the bottom of the mold – for EtBr, 0.2-0.5µG/ML通常使用。ETBR是诱变剂的证据仍然是目前辩论but consequently, many labs have moved over to alternatives⁶例如凝胶。加入凝胶，小心不要过度填充霉菌，并确保插入的染料均匀混合。当凝胶太热时不要倒入凝胶，否则模具可能会扭曲或断裂。

3。将样品/梯子与加载染料混合-加载染料执行多个功能。它们允许用户查看其原本无色的样品的位置，从而使样品准确地将样品移动到井中，从而降低了井之间样品交叉污染的可能性。当凝胶运行时，染料将与样品一起迁移，允许用户告诉样品中的凝胶中的位置，并防止其运行太远并丢失到缓冲区中。加载时，没有加载染料的DNA样品也会倾向于分散到运行缓冲液中，因为它们的密度较小。因此，大多数载荷染料都包含甘油或ficoll，这使样品型混合物更致密，因此它沉淀在井的底部。Bromophenol Blue是一种流行的着色剂选择，但有些还含有其他染料，例如二甲醇。可以购买加载染料的同时，许多实验室选择自己制作。⁷

如果您运行的样本很少（例如，小于5µl), it may be advantageous to add a littlewater在此阶段，使有效，均匀地加载凝胶井变得更加容易。同样，如果您期望某些样品中的DNA浓度比其他样品的浓度高得多，那么在此阶段，也可能有必要将这些浓缩样品的样品混合物加入水。如果不这样做，这些频段在可视化过程中给出的强信号会掩盖较弱的频带或要求强大的频带过度暴露以查看较弱的频段，从而在凝胶图像上产生明亮的，变形的区域。

4。加载凝胶- 从固定凝胶中卸下铸框/胶带，然后将其放入凝胶罐中，以确保井处于负端（黑色电极）。用运行缓冲液（TAE或TBE）填充水箱，以便将凝胶浸没。小心地卸下梳子，然后将样品型（如果使用的话）轻轻移动到孔中。尽量避免用移液器尖端触摸井的边缘，因为它们可能会破裂并允许一个样品进入下一个样本。超载井可以产生相同的结果。大量DNA在运行过程中也可以减慢DNA迁移。加载标记梯子，最好在样品行的两端。凝胶可能并不总是以完美的直线运行，因此在每一端都有梯子，可以更轻松地确定存在的片段尺寸。有各种各样的梯子，有不同尺寸的梯子；选择最适合您期望看到的碎片尺寸的一个。

5。运行凝胶- 将盖子用黑色和红色的电​​极将盖子放在水箱上，然后将电极插入电源包中，也将黑色至黑色和红色的电​​源包插入。这与凝胶罐一起组成了凝胶电泳机。确保电极和盖子是正确的方法，否则您的样品将向后跑出井中，进入运行的缓冲液。设置您的凝胶的时间和电压；120 V为35分钟是一个很好的近似值，但是应针对所用的凝胶百分比量身定制，并且预期的片段大小分开以提供良好电分离。将电流应用于琼脂糖凝胶会导致其加热，电压越高，其加热越高，因此在运行低百分比凝胶时，建议使用较低的电压来防止熔化。增加电压以使凝胶运转更快可能很诱人。但是，这可能会导致“笑脸”，其中频带在两端都向上弯曲，因此很难确定正确的带尺寸。这是凝胶开始稍微融化的地方，使乐队不均匀。这也会导致频段显得涂抹且定义不佳。

6。可视化- 一旦样品大部分沿凝胶沿着大部分路线运行（染料前面将使此可见），请关闭电源包。戴上手套，轻轻从水箱中清除模具中的凝胶，排除多余的跑步缓冲液，然后将其转移到适当的容器中的紫外线盒中进行可视化。更换手套，以防止周围表面，门把手等污染，并用凝胶或跑步缓冲液进行插入染料。如果下游应用需要DNA片段，则可以用手术刀刀片小心地从凝胶中切除相应的带，同时将其放置在黑暗房间的紫外线盒上。确保您戴上紫外线罩并在灯箱打开时保持皮肤覆盖，以防止紫外线损坏皮肤或眼睛。

如何读取凝胶电泳

Agarose gels may be visualized on a UV light box in a dark room or using a self-contained light box linked to a camera. Whichever system is utilized, UV light is shone through the gel from below and bands of DNA fluoresce thanks to the intercalating dye bound to them. This may be captured using a camera with a specialized UV filter for your records. Marker ladders come with a guide to indicate the size of each band they include. By comparing this to bands in sample lanes, the sizes of the bands can therefore be determined. The relative amount of DNA between samples may also be compared, as higher DNA concentrations will produce brighter bands. An example is shown in Figure 4.

图4： 琼脂糖凝胶（2％）分析来自从支气管肺泡灌洗中提取的DNA（BAL）诊断标本的DNA的分析。学分：疾病控制与预防中心。

凝胶电泳的目的是什么？

有很多原因是DNA片段的分离可能是可取的，其中许多是在整个生命科学学科中广泛适用的。让我们考虑一些常见目的。

• 样品DNA的可视化
  分离和可视化DNA片段使用户可以确定：
  
  样品中是否存在DNA- 例如，这可以确认是否是DNA提取或pcr已经起作用了diagnostic test因此，可以确定样品是正面还是阴性。
  
  这sizes of DNA fragments present- 例如，如果执行PCR或限制性摘要，是否是预期大小的频带？这可以确认基因工程实验是否成功或可能表明存在或不存在遗传插入，缺失⁸或重复区域⁹可以用作某些遗传条件的诊断工具。在准备DNA时下一代测序，，，，it is important that the fragmented DNA for library preparation is of the correct size for efficient sequencing.
  
  存在的DNA量- 尽管有更准确的方法可以精确DNA定量，¹⁰例如紫外线可见光谱，当在凝胶上运行样品时，产生的频带的强度可以使样品中相对于其他样品的DNA量大致了解。
  
  样品有多干净- 尽管在某些情况下（例如运行整个基因组DNA）可能会预期污染带，但通常会从PCR或限制消化中预期清晰，清晰的频带。弥散带或涂片可能表明次优的PCR条件或底漆，不完全消化或在DNA样品的情况下存在干扰污染物（例如RNA）。
  
• Separation of DNA fragments for purification
  下游应用需要DNA片段（例如克隆）¹¹或以下限制消化，可能希望将特定大小的DNA片段与总样本中的其他大小分开。为了实现这一目标，消化或放大的样品可能会在凝胶上用光，并切除包含感兴趣片段的凝胶。清理套件和协议^{12，，，，13}are available to purify the DNA from the agarose gel before proceeding to downstream steps.
  
• Southern印迹的DNA片段的分离
  南方墨是一种用于检测样品中特定DNA序列的技术。不过，为了做到这一点，必须先用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后才能探测目标序列。
  
• 电泳移动转移测定法（EMSA）
  Emsa的¹⁴也称为凝胶转移测定法，用于检测蛋白质与核酸之间的相互作用。示例可能包括约束转录因子¹⁵促进或预防基因表达。当蛋白质与DNA的片段结合时，它将改变其通过琼脂糖凝胶迁移的方式，从而产生“转移”。因此，通过有或没有假定的DNA结合蛋白的DNA片段的不同组合，可以确定结合何时发生或未发生，从而确定靶序列。

DNA琼脂糖凝胶电泳词汇表

学期	定义
Agarose gel electrophoresis	用于在琼脂糖基质中的大分子分离的一种电泳形式，例如DNA片段。
螯合剂	A chemical compound that reacts with metal ions to form stable, water-soluble metal complexes.
变性琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在破坏DNA，RNA或蛋白质的自然结构的条件下运行，从而导致它们展开。
去质子化	去除质子（h+）。
DNA梯子/标记梯	已知大小的DNA片段的溶液，可用于推断未知样品中片段的大小。
电分离	使用电流的大小和/或电荷的生物分子的分离，例如DNA，RNA或蛋白质。
电泳	A technique that uses electrical current to separate DNA, RNA or proteins based on their physical properties such as size and charge.
电泳移动转移测定法（EMSA）	EMSA也称为凝胶转移测定法，是一种基于电泳的技术，用于检测蛋白质与核酸之间的相互作用。
Gel electrophoresis machine	用于执行通常由带有连接电极的凝胶罐和电源包组成的凝胶电泳的设备。
插入染料	结合双链DNA的染料，使其能够在紫外线下可视化。
加载染料	一种用于制备DNA梯子和样品的电泳的染料，使它们可以用肉眼看到并增加其密度以防止分散。
Mutagen	促进DNA复制错误的化学或物理现象。
本地琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在允许保存生物分子（例如DNA，RNA或蛋白质）的自然结构的条件下运行。
北印迹	一种用于检测采用电泳进行样品分离的样品中特定RNA序列的技术。
核酸酶	裂解核酸（例如DNA或RNA）的酶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳	A form of electrophoresis used for the separation of macromolecules, such as nucleic acids and proteins, in a polymerized acrylamide matrix.
限制消化	A process that uses enzymes to cut DNA at specific sites according to the surrounding DNA sequence.
运行缓冲区	缓冲液用于填充凝胶浸入并将运行的水箱。它有助于保持稳定的条件。
二级结构	由相邻残基之间的静电景点产生的多肽或多核苷酸采用的3D结构。
Southern blot	一种用于检测采用电泳进行样品分离的样品中特定DNA序列的技术。
转录因子	Proteins involved in the process of converting, or transcribing, DNA into RNA.

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