CRISPR基因编辑技术的应用不断扩大。快速搜索最新的出版物中提及CRISPR揭示使用在植物基因组工程,若,基因筛查、治疗遗传疾病和诊断感染。

多才多艺的大部分来自CRISPR系统CRISPR -作为关联的蛋白质或ca蛋白分子剪刀,识别和降低特定的DNA片段。

自最初的发现的被称为CRISPR,6 ca的主要类型和超过22亚型蛋白已确定。

最有名的也许就是Cas9 -酶原基因编辑的变革是在2012年第一次描述了可编程功能Emmanuelle贝纳和詹妮弗Doudna。Cas12最近除了CRISPR万神殿,收集特别感兴趣的潜在的用于诊断。

但Cas9和Cas12之间的主要区别是什么,以及如何你可以决定哪些适合你的研究吗?

引入Cas9:原始CRISPR系统

Cas9蛋白被发现在几个的菌株包括年代treptococcus化脓性链球菌最初,双重RNA-guided DNA酶进化减少入侵的外来DNA。

在自然界中,Cas9需要两个RNA识别和削减目标——一个针对RNA叫CRISPR RNA (crRNA),这是一个目标DNA的复制,和一个结构组件称为trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA),形成一个复杂与crRNA Cas9所需的适当的集会和结社。

在他们的具有里程碑意义的论文、贝纳和Doudna的团队这两个RNA合成为一个指导RNA可以直接Cas9 sequence-specific削减DNA。

他们也表明指导RNA的核苷酸序列可以被编程为解理目标任何DNA序列,形成基因编辑系统的基础,继续赢得他们诺贝尔奖在2020年。

当它达到其目标,Cas9双链的DNA,从而能够插入、删除或修改特定区域附近的DNA。

Cas9于2012年被发现以来,许多做了进一步发展,包括变异与更大的准确性。例如,Cas9-HF1(或“高保真”)旨在减少非特异性联系,报告目标削减准确率在99.9%以上。大小优化也了,小版本的Cas9被发现在金黄色葡萄球菌在2015年。超过1 kb小于原Cas9从酿脓链球菌,这个小Cas9可以打包成单个腺相关病毒(AAV)向量和可能是一个有用的替代应用规模很重要。

Cas9提供高保真基因组编辑特别有用的研究和商业应用。这项技术已经在世界各地的实验室工作,产生近20000科学出版物和促进新产品的开发从转基因作物和牲畜到食品添加剂和美容产品。

Cas12: CRISPR家族的新成员

然而,Cas9不是城里唯一的Cas: 2015年Cas12发现的氨基酸球菌属和Lachnospiraceae家庭的细菌。这个新Cas已经大肆吹捧,但它如何不同于Cas9 ?

Cas12是单个RNA-guided核酸内切酶,这意味着它处理它自己的指导rna,所以只需要crRNA为目标,使其比Cas9较小的整体方案。能够设计一个针对crRNA Cas9或Cas12非常简单和这些系统的简单性和广泛使用的关键在基因组编辑。

Cas9被广泛报道比Cas12切割效率略高,但通常eclipse其他基因组编辑系统取得和锌手指时切削效率。Cas9叶钝端减少,而Cas12留下5 '过剩,但这似乎不会产生有意义的影响类型的编辑,可以完成。

一个重要的区别是,Cas9和Cas12认识不同PAM序列——针对DNA的短块所需的裂解位点旁边——对每个系统的整体效用广泛影响。

Cas9只需要一个“GG”序列相邻的目标,而原Cas12需要序列“TTTV”(V是一个,C或G),最近的衍生品的Cas12只需要“TT”。

然而,大多数哺乳动物基因GC-rich,这意味着它并不难找到必要的GG针对Cas9到特定的位置。相比之下,规范化Cas12 TT-rich PAM更丰富的细菌基因组,因此在哺乳动物基因组更有限的瞄准能力。基于此,许多研究人员发现Cas9更加灵活用于哺乳动物系统。

然而,研究人员发现一个独特的财产之外的另一个应用程序本身的Cas12基因组编辑:非特异性切割的单链DNA。这种能力已经变成了一个DNA诊断的有力工具通过检测少量的DNA来源如病毒和癌细胞。

虽然Cas12可能持有更多潜在的某些应用程序(如诊断,这是比Cas9发展的早期阶段,可能缺乏一些精密基因组编辑所需的精度。

最初和最CRISPR效应核酸酶,Cas9更长的研究历史,出版记录和更大的投资。出于这个原因,Cas9好去“正确的”,更适合商业需要和研究应用的准确性和可靠性,尤其是哺乳动物的应用程序。

表1:Cas9 vs Cas12——有什么区别呢?

	Cas9	Cas12(也称为Cas12a或Cpf1)
发现	2012年	2015年
中科院的家庭类型	II型	V型
大小	1000 - 1600氨基酸	1100 - 1300氨基酸
PAM序列	G-rich	T-rich
减少类型	钝3英国石油公司上游PAM	交错,18 - 23 bp PAM的下游
rna需要	crRNA + tracrRNA(或single-guide RNA)	crRNA
主要应用领域	哺乳动物基因编辑	非哺乳类应用程序和诊断
许多出版物	约20000年。	约1000年。

澄清Cas9和Cas12专利情况

专利技术,任何商业用途的CRISPR——从内部研发一直到市场——需要一个许可证的专利持有者(年代)。这是有点让人费解的地方。

CRISPR很快得到重视,因为它不仅科学潜力,已经有大量的媒体关注的各种专利纠纷在贝纳之间的技术,维也纳大学和加州大学(合称为CVC)和麻省理工学院。这两个组织的知识产权(IP)权利CRISPR技术的各个部分必须授权为了商业上使用。

最近的裁决2022年2月在美国下来支持广泛的团队拥有优先发明的具体使用single-guide CRISPR / Cas9系统在真核细胞。这引发了引人注目的标题和社交媒体喋喋不休,也许会让一些人错误地认为,CVC不再有任何专利权CRISPR / Cas9技术。

事实上,这最新的裁决不影响任何CVC授予我们基本专利成分和使用CRISPR / Cas9在所有设置,包括真核细胞,它在80多个国家包括欧盟、中国、日本和其他地方。

CVC保留权利超过40个美国专利覆盖范围的组成和方法CRISPR / Cas9基因编辑,并持有欧洲专利CRISPR / Cas9 DNA修饰的方法,包括使用的细菌,植物、动物和脊椎动物包括人类的细胞。

大多数商业研究与应用CRISPR / Cas9因此可能需要开始CVC执照,也可以从广泛的需要一个单独的许可证,根据地理区域和特定的用例。

相比之下,尽管最近轰动Cas9专利权、专利许可和景观Cas12更为复杂和不透明的。截至2020年,Cas12声称899个专利家庭世界范围内的使用和许可情况仍在争端,完全不清楚。

几个团体公开声称创造了Cas12衍生品的自由和明确的任何限制,但这些说法似乎可疑充其量给Cas12结构相似性和数量不断增长的专利申请在这个空间,希望抓住一块IP派。

CRISPR技术彻底改变了生命科学、开放新的可能性的新技术将有助于改变世界。反过来,这引发了一种可以理解的商业利益的公司从敏捷的生物科技初创企业通过建立更大的组织。选择正确的系统使用并获得适当的许可是一个至关重要的第一步探索这个新世界的机会。