自1970年代引入北印迹以来，以转录组为重点的研究已经走了很长一段路，随后是定量聚合酶链反应（QPCR）和微阵列技术。近年来，基于下一代测序（NGS）的技术的发展彻底改变了科学家分析基因表达和调节的方式。RNA测序（RNA-SEQ）使用NGS检测，量化和介绍转录组。与较旧的方法相比，RNA-Seq提供了更好的分辨率和覆盖范围，并且至关重要的是，不需要对分析的转录组的事先了解。这打开了更多的门从头发现。这些进步使科学家不仅可以量化基因表达，还可以发现新的成绩单，替代剪接位点和等位基因¹。RNA-Seq的广泛使用有助于削减设备成本，使得该分析高度易于访问，并在包括神经科学在内的几乎每个科学和医学领域都带来了突破性的发现。

神经科学方面的科学进步非常需要这种技术来解决科学家在人体中最复杂的器官时遇到的局限性。此外，尽管神经系统具有人体任何系统的细胞异质性最高，但这种细胞多样性的很大一部分和长距离连通性仍然在很大程度上未被发现。克服这些约束依赖于高通量，精确技术的开发和实施，例如适合神经科学的RNA-Seq。

这种技术进步的长期目标是更好地了解大脑的生理环境，介绍其转录组，并将其链接到大脑的独特生理学。在健康环境中识别这些机制将加快与疾病相关的表型和生物标志物的启示，并支持神经病理学的药物发现。比利时罗马尼亚比分直播

在此列表中，我们探讨了神经科学中使用的RNA-seq技术的主要方向及其对该领域的贡献。

1。单细胞RNA测序（SCRNA-SEQ）

解决大脑细胞异质性的问题需要在单细胞水平上探索系统。顾名思义，单细胞RNA测序（SCRNA-SEQ）由单个细胞中的基因表达组成。

SCRNA-SEQ工作流程首先是通过微流体系统，激光捕获显微解剖或荧光激活的细胞分选（FACS）隔离单个细胞，这是最常用的技术。这种孤立的材料成为由RNA分离和mRNA富集组成的RNA-seq分析的起点，随后片段化，转化为互补DNA分子（CDNA）以及添加测序适配器。与适配器结合的cDNA形成了“ DNA库”，将进行测序和分析。自2009年引入该方法以来²，开发用于SCRNA-Seq的不同平台为研究人员提供了选择，以根据细胞隔离方法，吞吐量级别，覆盖率和灵敏度找到特定项目的最佳解决方案³。

2。patch-seq

神经元膜电位是可激发神经细胞的基本特征，可以用斑块钳技术解决。贴片钳包括使用与细胞膜紧密接触的微孔测量细胞的电性能⁴。RNA-seq的技术进步引起了许多包括斑块序列在内的大脑特异性RNA-seq方法。它提供了全细胞斑块钳记录的组合以及对同一孤立神经元的RNA-seq分析。遵循经典电生理学记录⁵，提取并测序细胞RNA。最初成立于2015年⁵，在过去的五年中，已经看到了创新，例如实施更精确和分化的RNA-seq测量值，不仅涉及胞质RNA，而且还涉及树突和轴突的远端RNA⁶。斑块序列可以应用于不同的大脑区域，并对单个神经元的不同部位的整个转录组具有非常准确的视野。虽然斑块序列仍处于起步阶段，但这些功能使该方法非常有希望地研究与远端RNA和RNA贩运有关的疾病。

3。荧光原位RNA测序（Fisseq）

蛋白质表达的时空调节对于正常的脑功能和发育至关重要。在调节蛋白质亚细胞定位的途径中，mRNA定位是确保神经元细胞中正确蛋白质分布的主要机制⁷。研究沿着神经元的RNA运输对于理解大脑功能至关重要。最初，使用了这个问题原位RNA分析。这项技术的最大限制是，它仅限于少数批准的生物标志物。2015年，Wyss Institute的George Church团队通过开发Fisseq（RNA的原位测序）方法来克服这一问题⁸。Fisseq序列原位固定细胞或组织的整个转录组，并将表达水平与给定分子的空间定位联系起来。该技术由固定样品上的逆转录（RT）反应组成，该反应将RNA转换为互补DNA（cDNA）。在分子水平发生扩增反应之前，读取cDNA分子，并结合了可以通过共聚焦显微镜分析的荧光信号。FISSEQ方案适用于大量样品，包括培养的细胞，福尔马林固定石蜡嵌入（FFPE）和新鲜的冷冻组织样品，整个安装果蝇胚胎和类器官⁸。

4。通过测序（MAPSEQ）对投影的多路复用分析

神经回路是通过突触互连的神经元组，这些神经元可以位于远端大脑区域，但在功能上相互联系。追踪神经回路连通性的经典方法依赖于可以通过显微镜检测的染料注入神经元。最近，安东尼·扎多尔（Anthony Zador）的团队开发了一种新方法来跟踪单个神经元电路⁹。通过测序（MAPSEQ）对投影的多路复用分析包括将30bp序列的RNA条形码注入目标大脑区域。每个条形码将结合一个分子，该分子将通过单个神经元轴突途径传播到其最终突触目的地。之后，将大脑解剖为切片，并提取条形码的mRNA分子并进行测序，从源区域提供有关每个条形码RNA的电路模式的信息。这种新方法大大减少了单个神经元投射分析的时间，并大大增加了可以立即分析的神经元数量。

5.通过测序解决的条形码解剖结构（BARSEQ）

在2019年，Zador的团队介绍了升级的MAPSEQ版本 - 条形码解剖结构通过测序（Barseq）解决了。¹⁰。与其祖先类似，Barseq涉及使用靶向RNA的条形码的高通量映射。这里的新颖性是进行测序原位与MapSeq相比，将大脑切成切片，然后将RNA切成切片，然后将其萃取并测序。与使用MAPSEQ相比，此修改为条形码的初始位置以及跟踪电路提供了更高的空间分辨率。Zador和他的团队继续致力于下一代基于RNASEQ的映射技术，这将使我们更接近了解健康和神经病理学中的大脑连接性。

结论

RNA-seq方法中的革命涉及许多研究领域中看到的趋势 - 重点是高通量，单细胞技术。我们可以看到，RNA-Seq技术也正在以更有针对性的方式发展，以寻找解决当今神经科学中最突出的局限性的解决方案。当涉及到大脑时，新型技术正在尝试将RNA-Seq与其他参数结合起来，而对于神经元功能至关重要，例如电活动，信使分子定位或神经元电路组织。

随着这些方法发展的迅速发展，科学家们期望在大脑的复杂结构，过程和通信中获得更好的了解，并希望它在随后的几年中带来新的治疗解决方案。

参考：

1. Wang，Z.，Gerstein，M。＆Snyder，M。（2010）。RNA-Seq：转录组学的革命性工具。纳特。基因牧师10，57-63。
2. Tang，F。等。（2009）。单个细胞的mRNA-SEQ全转录组分析。纳特。方法6，377–382。
3. Mu，Q.，Chen，Y。＆Wang，J。（2019）。使用单细胞测序解密大脑复杂性。基因组学。蛋白质组学生物信息学17，344–366。
4. Segev，A.，Garcia-Oscos，F。＆Kourrich，S。（2016）。大脑切片中的全细胞贴片钳记录。J. Vis。Exp。，2016，1-10。
5. CADWELL，C。R.等。（2016）。使用斑块序列的单神经元的电生理，转录组和形态分析。纳特。生物技术。34，199–203。
6. Van Den Hurk，M.，Erwin，J.A.，Yeo，G.W.，Gage，F.H。＆Bardy，C。（2019）。CRRIGENDUM：分析来自人类多能干细胞的整个单个神经元的电生理学，形态和转录组的斑块序列方案。正面。摩尔。Neurosci。，12，11-12。
7. Zappulo，A。等。（2017）。RNA定位是富含神经突的蛋白质组的关键决定因素。纳特。社区，8，1-12。
8. Lee，J。H.等。（2015）。RNA的荧光原位测序（FISSEQ），用于完整细胞和组织中的基因表达分析。纳特。原始10，442–458。
9. Kebschull，J。M.等。（2016）。通过测序的条形码RNA对单神经元投影的高通量映射。神经元，91，975–987。
10. Chen，X。等。（2019）。使用原位测序对远程神经元投影进行高通量映射。细胞，，，，179，772-786.E19。