低温贮藏已成为日常生活不可或缺的一步的科学研究以及大量的医学应用,从辅助生殖、移植和生物标志物识别细胞疗法。它是几乎不可能的照片今天的科学和医学进步没有这种技术。

成功开发和实施所有的治疗和科学发现涉及低温贮藏依赖的正确和安全的翻译方法从实验室到临床和生产规模。

需要正确地使用这种技术,更多的研究集中于优化低温贮藏方法和调查的长期影响和后果是什么生理学的低温贮藏物质。

背后的物理低温贮藏

为了修改或排除一个协议,我们应该首先了解它是如何工作的。

低温生物学依赖于非常复杂的物理化学过程和反应,但短暂,随着温度的下降水从细胞外空间转换从液体到固体状态和冰晶的形成开始。水被投入到晶体溶质浓度增加,诱发细胞的渗透从里面流出。温度的控制减少需要确保足够的渗透压差,降低了细胞内的水位,从而防止冰晶的形成。同时水出口,冷冻保护剂剂进入细胞,增加其粘度,从而防止细胞因脱水收缩 ^{1 , 2} 。

即使正确和成功执行,所有这些事件有其负面影响细胞。脂质膜可以被破坏由冰晶或温度下降,脱水引起的结构变形细胞冷冻保护剂有细胞毒性效应。最终这些导致post-thaw生存能力下降和扩散,但也可能引发更深的和复杂的干扰细胞的身份和功能。

细胞疗法的成功依赖于良好的低温贮藏实践

低温贮藏的缓慢冷冻是保存在细胞培养的黄金标准。尽管这是一个主要技术用于基础研究,细胞疗法的兴起带来了许多问题在如何准确地执行这个过程和许多因素时,应考虑需要符合医疗或制造标准。

细胞疗法的一个重要组成部分的研究集中在成人干细胞(对asc)。对asc可以来自不同来源如外周血、骨髓和脂肪组织和显示强烈的承诺,因为他们的能力分化成人体的任何细胞类型。

在最近 工作 ³ , 的团队 迈克尔胡椒 在 细胞和分子医学研究所在比勒陀利亚,南非,探索低温贮藏的影响脂肪tissue-derived干细胞的分化能力(ADSCs)。在分析基因表达的脂肪形成的关键基因和细胞分化的程度,具有高水平的CD36和细胞内脂滴,科学家报道,缓慢冷冻细胞冷冻保存后不久他们隔离导致没有改变他们的区分能力。胡椒确信执行这样的必要性分析当同行重要的细胞池: “这post-thaw分析是至关重要的细胞功能来确定低温贮藏可能影响细胞。”

他的团队正在分析低温贮藏的影响在其他细胞类型主要用于细胞疗法,如血液干细胞和外周血单核细胞(PBMCs)。虽然他们没有观察主要改变immunophenotyping或post-thaw增殖的细胞,胡椒表达了他的担忧,更微妙的特点可能受到影响。

正确的低温贮藏的细胞用于治疗使用是至关重要的。“这是非常重要的特别的细胞可能会持续很长一段时间。这绝对细胞疗法的研究领域需要更多的关注,”胡椒说。此外,他的话反思需要评估不仅直接post-thaw复苏,但是,深入晚影响低温贮藏可能并确保移植细胞保存他们的治疗特性。

低温贮藏指南——细胞冷冻保存的基础研究和临床使用

低温贮藏已成为常规练习在生物医学研究和临床医学。当冻结并保持正常,标本可能无限期地在悬浮细胞的新陈代谢,可以根据需要解冻。收获的好处这一过程,重要的是要有一个全面的了解低温贮藏的关键方面。下载这个指南的基础细胞冷冻保存的研究和临床使用。

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玻璃化——新来的组织保护

其他主要使用的是玻璃化超低温保存技术。这两种方法之间的选择取决于材料的性质。玻璃化主要用于保护更大的样本如卵母细胞、胚胎、组织。

相比缓慢冻结,玻璃化依赖于材料的快速冻结,把它在高浓度的冷冻保护剂和接触液氮。这种方法允许直接转换的水从液体到固体状态没有晶体的形成。高度集中的冷冻保护剂防止冰的形成,因此没有必要进行缓慢冷却。

虽然玻璃化有很大的潜力,有几个参数的问题。快速和激烈的冻结可能由于高浓度的冷冻保护剂,但后者也与高毒性有关。在某些情况下,一个额外的限制是样品的直接接触与液态氮的细菌或病毒污染的倾向。

的团队 Christiani阿莫林 在实验和临床研究所鲁汶,比利时,接近玻璃化的挑战在卵巢auto-transplantation。卵巢auto-transplantation包括保留一块卵巢组织的活跃毛囊pre-therapeutic卵巢癌症病人,化疗常常有破坏性影响生殖器官。这个组织样本将守恒和auto-transplanted到患者的卵巢时,她已康复并希望怀孕。

在他们最近的 研究 ⁴ , 作者使用了玻璃化,冷冻保护剂的浓度逐渐增加,同时温度降低。这也避免了冰晶的形成和防止冷冻保护剂的毒性。

尽管加强玻璃化之前鉴于牛卵巢组织好的结果⁵,这不是人类卵巢组织。科学家们没有检测正常毛囊解冻后,与冷冻保护剂高毒性。的确,他们观察到所有的迹象二甲亚砜(DMSO) -相关细胞膜伤害:重要的细胞器的破坏,细胞膜分裂和细胞凋亡。这些观察意味着结果的可变性的方法可以给当应用于相同类型的组织,而是来自一个不同的有机体。

阿莫林是对未来积极的方法,认识到有必要进行进一步的研究主题:“我可以看到一个巨大的潜力在了玻璃化方法,但我 也相信我们仍然有很多需要学习思考之前使用它作为人类卵巢组织冷冻保存方法的选择。冷冻保护剂浓度高,应该应用于这种方法是我的第一个问题。(…)我们的研究明确显示,50% DMSO太高,所以我们需要尝试低浓度或结合它与其他冷冻保护剂。”

最关键的点是最被忽视的吗?

虽然广泛和日常使用,冷冻的方法生活一段时间之后,随后的复兴,依赖于复杂的物理原理,没有广泛的理解和考虑。” 大多数科学家使用的技术有可能有一个有限的理解物理低温贮藏,“胡椒说。 阿莫林是在同一页谈到这个问题: “我认为我们大多数的一部分,科学家,不抓住这样的过程涉及到的复杂性。”

整体有限的理解往往会导致这一事实最临界点的协议是最被忽视的。可能出现低温贮藏最具挑战性的部分是长期储存的材料在极低的温度下,事实上它不是。冷冻保护剂剂的类型和浓度以及时间冻结下来细胞的数量根据胡椒扮演更重要的角色。同时,阿莫林提醒我们,解冻的步骤,往往忽视。

未来的视角

如果有一件事可以确定,那就是低温贮藏在这里留下来,并将未来发展不可缺少的科学研究和发展的治疗方案。我们需要解决的问题是如何评估,防止负面影响低温贮藏对生物材料。“低温贮藏需要优化和标准化的优化技术将允许我们进行比较和解释数据中删除一个潜在的混杂变量。一个自动化的方法基于验证参数将协助在这方面,“胡椒是说服。

阿莫林设想低温贮藏发展方向相同: “我认为第一步是要有一个健壮的程序,然后开发一个低温贮藏机,可以同时处理多个样品。”,也意味着进一步评估的重要性低温贮藏的后果不仅活力,但在更深层面上:“一旦我们找到一个可以保护卵泡池的协议,我们需要确保最终冷冻保护剂浓度不会干扰表观遗传机制,特别是基因组印记。”

这将是有趣的,看看需要准确性和升级将调节这脱胎技术和进一步的理解将会带来的影响。

教授 essor 迈克尔胡椒 和 教授 essor Christiani阿莫林 对玛雅Chergova博士为技术网络。捷克葡萄牙直播 教授Michael胡椒是一个领域的专家细胞疗法和细胞和分子医学研究所主任比勒陀利亚大学的南非。 教授 essor Christiani阿莫林教授 实验和临床研究所鲁汶天主教大学、比利时。她有着丰富的经验在卵巢和卵泡冷冻保存和移植方法的发展。

引用

1. 森林,e . J。,Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D. & Mathew, A. J.(2016)。现成的细胞疗法:考虑因素在人类细胞的冷冻保存和存储供临床使用。Cytotherapy18,697 - 711。
2. Bakhach, J。(2009)。复合组织的低温贮藏:原则和最近发展低温贮藏的不同类型的组织。器官发生5,119 - 126。
3. Durandt C。,Dessels, C., da Silva, C., Murdoch, C. & Pepper, M. S.(2019)。轮体外早期扩张的影响,低温贮藏脂肪形成的脂肪基质/干细胞的分化能力。科学。代表。9,1-13。
4. 曼扎诺,e·c·R。et al。(2019)。加强玻璃化技术对人类卵巢组织冷冻保存。科学。代表。9,1 - 12。
5. 畜栏,。等。(2018)。玻璃化,monitore卵巢组织冷冻保存d通过x射线计算机断层扫描。低温生物学,81年,17-26。