从制药和食品到体液和土壤,分析实验室已经越来越需要精确测量的微克和sub-microgram数量的目标,有时在复杂的矩阵。尽管这并不意味着任务本身,可能需要分析数以百计的样品尽快同时确保数据质量增加了额外的挑战。

耦合的液相色谱法(信用证)质谱分析(MS)为分析科学家们提供了一个强大的工具来满足这些苛刻的要求。由于其多功能性和效率,液相色谱-光谱法(质)在许多现代分析实验室仪器已成为理想的。

质是什么?

质是一种分析技术,包括物理分离的目标化合物(或分析物)其次是大众型检测。虽然相对较新的,其灵敏度、选择性和准确度的首选技术检测微克甚至纳克量的各种分析物从药物代谢物、农药、食品添加剂、天然产物提取。

质是如何工作的呢?

LC分离

信用证带来一个物理分离的液体样品中的分析物或固体样品的解决方案。几毫升的样品溶液注入溶剂流流动,称为流动相。而最优注入体积取决于实验条件,可以注入只要0.1µL多达100µL样本的准确使用autosampler。¹流动相不断注入通过一列(不锈钢管)通常充满了二氧化硅粒子涂上另一种液体,固定相。当样本solution-mobile阶段混合到达列,其与固定相交互的组件将不同(仍在列)取决于他们的化学成分和物理性质。根据分析物与固定相之间的相互作用机制,LC分离被分为不同的模式,例如:

——分配色谱法——基于不同的溶解性和疏水性分析物的固定相相比,流动相。

- - - - - -离子交换色谱法-分离的基础上分析物离子的指控。

- - - - - -凝胶排阻层析法——利用的差异分析物的大小分子分离。

——亲和色谱法——把分析物基于债券的固定相的能力。

一些分析物会比其他人更与固定相之间强烈的相互作用,导致了他们的分离,因为他们通过列。最少的分析物与固定相交互的第一列。随着流动相继续流经列,剩下的顺序分析物被刷新,那些最强大的新兴的交互。一个特定的分析物的时间花的列是特征分析物和被称为其保留时间(RT)。

LC检测

列的流动相流出(洗脱液)通过一个探测器,“响应”一定的物理或化学性质,如折射率、光吸收的分析物。这个响应被作为信号或“峰值”的强度(峰面积或峰高)对应组件中样本的数量。的时间探测器“看到”分析物是其沿样品中化合物的身份可以证实通过比较其RT的RT已知的化合物。虽然这不是一个准确的复合识别方法,它有助于在一些关于样品的信息先天的。

使用女士LC检测

尽管各种各样的探测器的不同技术和敏感加上LC分析不同样品类型,质谱计已经成为一个选择性、敏感和环球探测器。

不像其他的探测器,LC洗脱液携带分离分析物是不允许流入质谱仪。在LC系统操作的环境压力,质谱仪在真空下操作和两个耦合通过一个接口。随着柱洗脱液流入接口,溶剂蒸发通过加热和蒸发和被分析物分子电离。这是一个关键的一步,质谱仪只是探测和测量气相离子的能力。

在大气压力的分析物离子生成接口,这个过程叫做大气压电离(API)和接口被称为API来源。电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)是最常用的源质分析。

分析物离子被吸引到质谱计他们在哪里受到电场和/或磁场。离子的飞行路径改变通过改变确保他们的应用领域分离从一个另一个的基础上他们的质荷(m / z)值。离婚后,离子可以被各种各样的收集和检测质量检测器,²其中最常见的一个是电子倍增器。当分离离子罢工的表面电子倍增器(打拿极),二次电子被释放。这些次级电子乘以级联通过一系列的打拿极。放大电流的流动所产生的二次电子的离子浓度测量和相关质谱仪在任何给定时刻(图1)。

图1: 一个质设置原理图的例子。信贷:Cwszot Dagui1929、CasJu YassineMrabet,复制下Creative Commons CC0 1.0通用公共领域奉献许可证。

绘制数据质

离子丰度的测量在分析样品的质是策划作为一个总离子色谱图(TIC)。这张图显示了峰值强度进一步的分析物离子与rt,每个点的色谱与质谱。质谱描述了离子丰度与测量m / z值(图2)。

图2: 示例输出情节从质分析。信贷:丹尼尔Norena-Caro,复制下 Creative Commons CC0 1.0通用公共领域奉献许可证。

化合物的质谱不仅提供信息母体化合物的质量(m / z值的离子),但也有助于阐明结构的化合物的相对丰度同位素质量高峰。分析物峰的面积用于量化。

质谱仪可以以两种模式操作,a)扫描和b)选择离子监测(SIM)。在扫描模式中,它将检测所有的离子从低高m / m / z z值在指定时间段内。使用这种模式在分析未知样品或当没有可用离子存在于样本的信息。当在SIM运营模式时,质谱仪测量特定的m / z值。这是首选的操作模式样本的已知化合物的精确量化。

结合液相色谱串联质谱(质/女士)

进一步改善样本识别和精确量化可以通过耦合两个串联操作的质量分析器。三重四极质谱仪(回调或全面质量管理)和四极飞行时间(QTOF)是最常用的串联质谱仪。这些配置提供几个样品分析的可能性。

全面质量管理由两个四极质量分析仪(问₁和问₃)碰撞分离的细胞(q / q₂)。尽管问₁和问₃运营质量分析仪扫描/质量范围或监控特定的离子m / z值,碰撞细胞用于片段前体离子隔离在问₁通过高能碰撞与中性气体,如氩、氦、氮。可以操作全面质量管理在四个不同的模式⁵(图3),即:

——前体离子扫描——第一个四极(Q₁)扫描质量范围来选择特定产品的前体离子(m / z值),然后监测在过去四极(Q₃)。

——产品离子扫描——问₁设置传输只预定义的前体(m / z)碰撞细胞,而问₃是扫描质量范围确定的实验条件下获得的片段。

-中性丢失(NL)——这两个问₁和问₃扫描识别的前体产生损失的产品相同的中性(卸货)物种的前兆。问的扫描范围₃是问值所抵消。

-选择反应监测(SRM)——这两个问₁和问₃设置监控特定的前体和产品离子m / z值。这种模式更适合复合量化由于其特异性和敏感性。全面质量管理可以监视多个precursor-to-product转换操作的相同以及不同分析物。

图3: 全面质量管理的模式操作。

分裂取决于分子的结构和实验条件,如气体压力和碰撞能量。因此,在特定的反应条件下,使用分段模式以及复合RT和识别它的准确质量值。此外,监控特定的碎片离子有助于提高检测的灵敏度,从而使少量的量化目标化合物。

QTOF质谱仪的四极质谱分析器和飞行时间质谱仪碰撞细胞分离。可以使用四极离子传输或隔离一个特定的前体离子碰撞细胞然后支离破碎。的一小部分离子TOF分析仪的第一个脉冲调制器,随后加速到高真空的舞台区域采用高电压。离子与不同的m / z值旅行在不同速度的飞行管和分离。TOF质量分析器提供高质量的决议而能够在大质量范围快速扫描。

质分析

但是有的已经广泛应用的分析小分子和蛋白质分子大不同的矩阵。这种技术的应用的一些例子:

量化的基因毒性杂质活性药物成分⁴

- - - - - - 检测12个模型化合物表示特定类的掺杂剂,如合成代理和模拟的,呼出的气息⁵

——量化药物在生物体液代谢物

——检测食品中的添加剂材料⁶和膳食补充剂⁷

——确定烷基酚乙氧基化物(APEOs)制革厂沉积物⁸

——量化游泳池和个人护理产品的河水样品⁹

——量化细菌细胞的核苷酸及其衍生物¹⁰

量化的蛋白质组

——作为一个快速测定SARS-CoV-2的检测¹¹

但是有的优点和局限性

的优势

但是有的适用于极性和非极性化合物的分析,以及热不稳定的分子。这些化合物可以从低分子质量分析物与m / z值< 1000 Da,高分子量蛋白质与m / z值> 100000哒。的“软电离”主要给出了分子离子和化合物的同位素峰有助于准确的测定分析物的质量和假定的公式。加上碎片光谱,可以阐明分析物的结构。

虽然,通常几毫克的纯化合物所需分析质1毫克可以足够。通过操作SIM的女士或SRM模式,可以实现检测的局限性在ng / mL的范围甚至pg / mL。只有特定的离子在SRM监控模式,实现选择性甚至对分析物在复杂的矩阵。

限制

质仪器昂贵,操作和维护。专业知识需要运行仪器和分析数据。样品处理量是温和相比其他分析技术。以来获得的光谱依赖于实验条件,包括仪器类型、复合识别的范围通过与参考光谱是有限的。质谱仪是一种破坏性的探测器,必须小心处理样品时可能无法轻易获得,或者没有获得大量。作为实验室而不是攷虑技术,分析不稳定或由质活性样品可以证明具有挑战性。

只能注入液体样品的专栏中,固体样品必须溶解在合适的溶剂,或分析物从样品中提取。样品制备的技术,如液-液萃取(米歇尔)或固相萃取(SPE)是必不可少的目标从复杂样品分析物的提取,如血浆、食物和土壤。¹²这不仅有助于提高分析的灵敏度,而且还减少了污染(在下一节讨论)的系统。

常见问题与质

而质带来几个优点的痕量分析复杂的矩阵,需要采取几个措施克服以下挑战在使用这种技术。¹³

污染

灵敏度、选择性、再现性和分辨率的分析是影响污染物,如金属离子、邻苯二甲酸酯、聚乙二醇(PEG)、滑剂,水和颗粒进入系统等各种来源:

——试剂和溶剂
——水用于准备缓冲区
由玻璃器皿浸出的化学物质
——微型离心机管
-入口过滤器
——溶剂线
-仪器部件,如泵密封
——气体用于反溶剂洗脱液的细胞来源和碰撞
——样品本身

污染物可以干扰的分析:

——抑制或提高分析物的电离源(s)
与分析物,形成加合物
——屏蔽分析物的山峰和/或出现鬼峰的色谱图
——使基线噪声
——污染系统和列,需要频繁的维护和更换的部件

以减少污染:

——高纯度溶剂、水和试剂的准备应该用于移动阶段。
——刚做好的移动阶段必须被用来减少微生物污染的水流动相的机会和乙腈(ACN)的聚合。
——使用肥皂或洗涤剂清洗玻璃器皿应该避免,因为他们很难去除,可以在分析造成干扰。
高纯气体(例如,常用的氮气纯度> 95%)必须使用。
-氮发电机必须维护良好,必须更换气瓶时,压力低于可接受的水平。
——必须从样本中提取矩阵分析物和色谱参数优化以提高分析物峰的干扰峰的分辨率。

基体效应

在分析生物样品时,其他样品成分可以抑制或增强电离源的分析物。最小化的影响矩阵,感兴趣的分析物应该是孤立的。因此,质分析的样品制备是一个重要的先决条件。虽然这降低了基体效应,很难只提取分析物(s)的矩阵。防止干扰化合物,co-elution色谱参数也可以优化。制备的标准解决方案analyte-free矩阵(矩阵匹配)也有助于解释,基体效应。已知浓度的isotopically-labeled内部标准,经历类似的电离抑制或增强,用于补偿矩阵的影响。

结转

分析物峰可能出现在空白注射高浓度样品后运行结果示例结转。这必须解决清洁使用的协议,如重复注射空白,针洗和列调节,确保分析的灵敏度。

样品损失

分析物,如蛋白质和DNA,可能会丢失,由于非特异性结合实验室耗材,如微型离心机管的内表面。分析物的吸附影响测定的准确度和精密度。分析物的损失可以最小化通过使用容器表面附着力较低。另一种方法是添加阻断剂,减少交互的分析物与容器的内表面。¹⁴

流动相缓冲选择

随着柱洗脱液要删除之前女士分析,只有不稳定的缓冲区,如甲酸铵和乙酸铵在源不会沉淀,可用于移动的准备阶段。

维护

定期维护的质谱仪必须按预先确定的时间表执行,确保准确性、重现性和无故障操作仪器和减少计划外停机。

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