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什么是RNA-Seq？
RNA-seq (RNA-sequencing) is a technique that can examine the quantity and sequences of RNA in a sample usingnext-generation sequencing (NGS)。It analyzes the transcriptome, indicating which of the genes encoded in our DNA are turned on or off and to what extent. Here, we look at why RNA-seq is useful, how the technique works and the basic protocol that is commonly used today.1
RNA-Seq如何工作？
RNA-seq vs microarrays: Why RNA-seq is considered superior
RNA-seq协议
-实验计划
-cDNA库制备
-cDNA测序
-RNA-seq data analysis
RNA-Seq的挑战
RNA-Seq的应用是什么？
RNA-Seq让我们investigate并发现转录组，即RNA的总细胞含量，包括mRNA，rRNA和tRNA。如果我们要将基因组中的信息与其功能蛋白表达联系起来，那么了解转录组是关键。RNA-Seq可以告诉我们在单元格中打开了哪些基因，它们的水平是多少transcriptionis, and at what times they are activated or shut off.2这使科学家可以更深入地了解细胞的生物学，并评估可能表明疾病的变化。使用RNA-seq的一些最流行的技术是转录分析，单核苷酸多态性（SNP）识别，即3RNA editing and differential gene expression analysis.4
这可以为研究人员提供有关基因功能的重要信息。例如，转录组可以突出显示未知功能基因的所有组织，这可能表明其作用是什么。它还捕获有关替代剪接事件的信息（图1），该事件从一个基因序列产生不同的转录本。这些事件不会被DNA测序拾取。它也可以识别转录后修改在mRNA处理期间发生的，例如聚腺苷酸化和5'限。2
图1：RNA-Seq数据使用的简短读取mRNA，该mRNA不含内含子非编码DNA。然后必须将这些读取与参考基因组对齐。
RNA-Seq如何工作？
早期的RNA-Seq技术使用了Sanger测序技术，尽管当时的创新性也是低通量和昂贵的技术。直到最近，NGS技术，have we been able to fully take advantage of RNA-seq’s potential.5
RNA-Seq工作流有多个步骤，可以大致总结为：
- RNA提取
- 逆转录到cDNA
- 改编的连接
- Amplification
- Sequencing
一旦获得了RNA样品进行分析，该技术的第一步涉及将RNA的种群转换为接收DNA（cDNA）片段（cDNA库）。这是通过逆转录完成的，并允许将RNA放入NGS工作流程中。然后将cDNA碎裂，并将适配器添加到片段的每一端。这些适配器包含功能元件，允许测序，例如放大元件（促进片段的克隆扩增）和主要的测序启动位点。随后，随后进行扩增，尺寸选择，清理和质量检查的过程，然后通过NGS分析cDNA库，从而产生与所得出的全部或部分片段相对应的短序列。测序库的深度取决于使用输出数据的目的。测序可以遵循单端或配对的测序方法。单阅读测序是一种更便宜，更快的技术（参考，约占Sanger测序成本的1％），它仅一端从一端进行cDNA片段进行了序列。两端的配对端方法序列，因此更昂贵6，，，，7但是在后续数据重建方面提供了优势。
必须在链特异性和非链特定方案之间做出进一步的选择。前一种方法是指保留有关DNA链的信息。从特定于链的协议中获得的额外信息的价值使它们成为有利的选择。
这些读物将在工作流程结束时有数百万美元，然后可以与参考基因组对齐或组装从头产生跨转录组的RNA序列图。8
RNA-seq vs microarrays: Why RNA-seq is considered superior
RNA-seq is widely regarded as superior to other technologies, such as microarray hybridization. There are several reasons for RNA-seq’s well-regarded status:
不限于基因组序列 -与可能需要物种特异性探针的基于杂交的方法不同，RNA-Seq可以从具有先前未确定的基因组序列的生物体中检测转录本。这使得检测新的转录本，SNP或其他变化从根本上使其更高。9，，，，10
低背景信号 -the cDNA sequences used in RNA-seq can be mapped to targeted regions on the genome, which makes it easy to remove experimental noise. Furthermore, issues with cross-hybridization or sub-standard hybridization, which can plague microarray experiments, are not an issue in RNA-seq experiments.
更量化 -相对于阵列上检测到的其他信号，微阵列数据仅作为值显示，而RNA-Seq数据是可量化的。RNA-Seq还避免了微阵列在检测非常高或非常低转录水平的问题上存在的问题。
图2：RNA-seq的工作流程
RNA-seq协议
实验计划
在开始RNA-Seq实验之前进行准备是必不可少的。开始之前要回答的问题包括：11
•您正在使用哪种RNA纯化方法？
•您需要什么阅读深度？
•您将使用哪个平台？
•是否有参考基因组，您将使用哪个？
•您如何评估RNA的质量？
•您需要丰富目标RNA吗？
•您会将RNA编码吗？
•我有足够的生物学和技术复制吗？
•单端还是配对的测序？
• What read length will you use?
• Do I want to retain strand-specific information?
cDNA库制备
考虑这些要点后，您可以开始准备cDNA库。这将需要碎片碎片，添加平台特异性的“适配器序列”和cDNA的扩增，但是确切的过程将非常特定于此阶段使用的平台。对于链特异性方案，cDNA的扩增涉及逆转录酶介导的第一线合成，然后进行DNA聚合酶介导的第二链合成。11，，，，12还可以添加条形码，即启用多路复用，因此可以在一次运行中测序许多样品。在图书馆准备阶段结束时量化图书馆以确保协议已成功并检查库的质量和集中度以实现最佳测序性能是有益的。
cDNA测序
准备库后，您可以使用所选的测序平台将cDNA库对所需的深度和需求进行排序。产生笔录数据后，您可以将数据映射到参考基因组或组装从头如果没有参考。剪接变体和修改的存在可能使对齐过程变得复杂，并且所使用的参考基因组的选择也会改变这个阶段的难度。在此阶段，诸如Star之类的软件包以及Picard或Qualimap等质量控制工具也很有用。13 从头除了已经知道的那些人之外，组装还将允许发现新颖的成绩单。
RNA-seq data analysis
在对齐阶段之后，您可以专注于analyzing your data。Sailfish，RSEM和BITSEQ等工具13将帮助您量化转录水平，而量化剪接基因的MISO等工具可用于更专业的分析。14这些工具有一个库，阅读评论和综述是找到合适的研究工具的最佳方法。
To sum up, modern-day RNA-seq is well established as the superior option to microarrays and will likely remain the preferred option for the time being.
RNA-Seq的挑战
在过去的十年左右的时间里，RNA-Seq领域取得了重大进展。相关成本显着降低，而吞吐量增加，序列保真度远远优于NGS技术的早期迭代，并且数据分析工具和管道的可用性大大提高。但是，在考虑RNA-seq实验时，科学家仍有许多挑战要牢记。这些包括：
隔离足够高质量RNA– while the sample quantity requirements for RNA-seq analysis have reduced drastically, it is still important to ensure you are able to obtain sufficient RNA to fulfill all your analysis requirements, including repeats if necessary. It is also important to bear in mind that, while you may isolate total RNA, depending upon your experimental question, you are likely only to besequencing a fraction其中（通常是信使RNA（mRNA）），进一步减少了样品数量。这也必须具有高质量和纯度，因为较差的样本可能导致效果不佳，或者在某些情况下图书馆准备方案中的失败。可以使用RNA的质量和浓度来确定UV-visible spectroscopy。与DNA不同，RNA迅速降解，因此在隔离和纯化的各个阶段都要谨慎处理样品很重要。降解可能不均匀，阻碍了基因之间转录水平的比较。低水平的成绩单可能完全从测序的人群中丢失。
The impact of sample pooling- 在库准备之前（不使用条形码）在图书馆准备之前进行汇总样品可以减少测序工作和成本，或者在样本数量非常有限的情况下启用测序。但是，重要的是在数据分析期间考虑到这一点，其中一个这样的池认为是一种生物学重复，但是并非有很多样本用于构成池。合并样品之间的变化会导致误导性结果和统计问题因此，在实验设计过程中应考虑可能的含义。
交易序列深度针对样品编号- 在一次测序中完成尽可能多的样本以减少成本和机器时间似乎很有吸引力。但是，这是有代价的。越多的样品多路复用，对于每个样品中的每个样品的读取就会越少。随着读取深度的减少，对于获得的序列的可靠性而存在不确定性。测序技术仍然远非完美，并且在阅读中犯了错误。因此，重要的是要找到获得足够的读取深度以使获得的测序数据的质量和忠诚度和最大化测序能力以确保确保的质量和保真度之间的甜蜜点很重要。足够的生物学重复可以分析以提供有意义的数据。
参考
1。Wang Z, Gerstein M, & Snyder M. RNA-seq: a revolutionary tool for transcriptomics.纳特。基因牧师，2009; 10（1），57-63。doi：10。1038/nrg2484
2. Ozsolak F和Milos PM。RNA测序：进步，挑战和机遇。纳特。基因牧师，2011;12（2），87–98。doi：10.1038/nrg2934
3. Bakhtiarizadeh先生，Alamouti AA。基于RNA-Seq的遗传变异发现为控制绵羊尾部的脂肪沉积提供了新的见解。Sci代表10，，，，13525(2020). doi:10.1038/S41598-020-70527-8
4. Han Y，Gao S，Muegge K，Zhang W和ZhouB。RNA测序和挑战的高级应用。生物知识。生物。见解，2015; 9（Suppl 1），29-46。doi：10.4137/BBI.S28991
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7.功能基因组学II。embl-ebi。https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/functional-genomics-ii-common-technologies-and-data-analysis-methods/rna-sequencing/performing-a-rna-seq-experiment/design-considerations/。Accessed September 6, 2021.
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9. Zhao S，Fung-Leung W-P，Bittner A，NGO K和Liu X.活化T细胞的转录组分析中RNA-Seq和微阵列的比较。PLOS ONE，，，，2014;9(1), e78644. doi:10.1371/journal.pone.0078644
10. Rao MS，Van Vleet TR，Ciurlionis R等。RNA-SEQ和微阵列基因表达平台的比较，用于对短期大鼠毒性研究的肝脏评估。正面。基因。2019; 9：636。doi：10。3389/fgene.2018.00636
11. Kukurba KR，蒙哥马利SB。RNA测序和分析。冷泉亨布尔。2015; 2015（11）：951-969。doi：10。1101/pdb.top084970
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