流式细胞仪是一种单个细胞技术，它利用激光和荧光（在大多数情况下）研究细胞的基因表达谱和功能。流式细胞仪的功率是其以高速率（每秒30,000个单元格）和多参数（通常为15或16，但在单个样本中延伸至40+）的能力。流式细胞术最初在免疫学领域开发，现在在整个生物科学及其他地区都有应用。成功的流式细胞仪实验始于良好的样品制备。

1.样品来源

流式细胞术一次通过一次通过一系列激光器来测量单个细胞的特征。这需要样品在单个细胞悬浮液中。如果我们正在研究血液或灌注液的细胞，那么产生单个细胞悬浮液的生成相对简单，因为细胞本质上没有物理彼此附着。但是，生物学家通常对与组织相关的细胞感兴趣，这使产生单个细胞悬浮液更具挑战性。

组织是在复合物中紧密连接在一起的不同细胞的集合。我们需要取笑这种复合物，同时维持细胞活力，生理稳态和抗原完整性，以便能够进行准确的流式细胞仪分析。例如，某些组织（例如脾脏）相对较软，并且通过将其通过100μm的网格与注射器柱塞或类似的背面推动，很容易被分解。由于这涉及没有酶促作用细胞活力，并且抗原不受影响。

但是，大多数组织都更具挑战性！在这些情况下，需要更多的“肌肉”来分解细胞和酶，通常一起使用温度和机械技术来产生单个细胞。这些方法可能对细胞非常有害，并导致广泛的细胞死亡和抗原丧失。

用于执行组织消化的协议可从许多来源在线获得。但是，可以在Worthington Biochemical Corporation网站上找到有关所有组织消化的高度综合指南。¹这是最初指导的绝佳资源，可以将各种各样的组织与一长串生物分类。

消化组织的一般方法遵循涉及组织机械“切碎”的方案，然后进行酶消化和最后过滤。

要了解协议，我们需要考虑每个步骤的潜在陷阱。

2.机械技术

从生物体中切除组织后，将尽可能多的不需要的脂肪和组织解剖，以提高协议其余部分的有效性。机械技术，例如用手术刀切碎或用剪刀切碎，然后进行注射和滤波，用于粗糙地分解组织并增加酶可访问的表面积。重要的是要在适合该方案的酶阶段的缓冲培养基的存在下进行机械破坏。例如，酶可能需要二价阳离子才能起作用，在这种情况下，您应该避免使用EDTA等螯合剂。如果使用胰蛋白酶，则应使用不含镁或钙的平衡盐溶液。产品应与产品一起提供最合适的缓冲区的说明。如果没有，可以通过一些研究找到合适的缓冲信息。

3.酶消化和孵育温度

由于酶在生理温度下具有活性，这是细胞通常处于最活跃的地方，因此一起讨论了这两种技术。因此，由于细胞不超出其生理环境，因此潜在的孵育期可能会增加样品死亡，并可能会引起异常信号传导或其生理变化（受体内在化或激活）。通常，I型胶原酶用于消化组织，但可以使用其他酶（例如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶）。这三个都是蛋白水解酶的示例，它们在特定序列上切割蛋白质。请小心，如果您的靶抗原中存在裂解序列，则它也将被裂解，因此在下游分析中不存在。

从生理方面来看，重要的是要优化孵化温度和时间，以使酶能够做“事物”，而不会对样品产生不利影响。很难说应孵育多长时间以获得最佳的消化，通常在37°C下1或2小时就足够了。孵育应允许足够的时间消化组织，但不会长时间增加细胞死亡 - 这会根据组织的类型而变化。密切关注该过程，一旦样本出现均质，就可以停止消化，因为过度消化绝不是一个好主意。请注意，某些类型的胶原酶需要长达18小时的孵育时间。

优化孵化时间和温度通常是一个经验过程，需要仔细的平衡行为和试验和错误的要素。细胞降解可以通过降低孵育温度来降低，但因此可能会降低酶活性。然后需要增加的孵育时间，然后可能再次增加细胞降解。

胰蛋白酶是一种强大的组织分解酶，如果在37°C下孵育太长，可能会导致样品损失。使用胰蛋白酶，建议您在4°C下进行过夜孵育，以使酶渗透到组织。然后，第二天应将样品在37°C下孵育30分钟，以分解。

关于酶的一句话，以及要考虑的一句话。酶是生物学剂，因此将包含活性的变化。酶的质量在制造商的纯度方面可能会有所不同。酶也可能从批量到批量各不相同，在很长一段时间内与它们一起工作时可能会令人沮丧。购买酶时，请确保您能够执行优化和尽可能多的实验，并且您可能会想到！另外，请与制造商联系，因为许多人可以根据要求提供特定地块的库存。

在消化步骤之后，我们通过将大约2％血清（例如胎牛血清（例如FBS））添加平衡的盐溶液（例如Hanks平衡盐溶液）来消除酶的活性。在这一点上，您应该有一个松散的组织制备，可以通过与1ml或10ml移液器（取决于体积）将其分离成单个单元。

通过在大约300-400 x g处离心5分钟（带有制动器），从初始悬浮液中恢复细胞，以去除细胞中的残留酶。重悬于平衡盐溶液中的所得沉淀后，将样品通过合适的过滤器（我们经常使用100UM滤镜）从样品中删除任何最终聚集体，并执行单元格/生存能力评估（请参见下文）。理想情况下，消化后的所有步骤将在冰上或在降低的温度下进行冷藏和冷离心，以避免任何进一步的细胞活性并最大程度地减少细胞死亡。

4.死细胞

死细胞在分析中可能是一个真正的问题，并且在用流式细胞仪抗体染色方面可能是一个主要问题。

死细胞很容易结合非特异性产生人为数据和假阳性染色的抗体。在垂死的过程中，他们还将大量DNA释放到培养物中 - 使样品具有“鼻涕”外观 - 这会导致细胞粘在一起并又死亡。如果发生这种情况，则可以使用DNase轻松去除解放的DNA，DNase可以添加到许多组织制备缓冲液中。

遵循消化协议，最好检查细胞活力。这可以通过多种快速，简单的方法来完成。传统上，在将其应用于血细胞计（计数室载玻片）之前，将锥虫蓝与细胞样品的等分试样轻轻混合在一起，并用作评估样品生存能力的差异污渍。当观察光显微镜锥形时，蓝色突出显示了具有强烈蓝色的死细胞，并允许对非蓝色（活）和蓝色（死）细胞进行计数。最近，基于对活细胞的荧光歧视的高效系统已使用，这些系统采用了内置的显微镜和相机来进行计数和评估可行性。诸如脆皮橙之类的污渍用于标记所有细胞，碘化丙啶或DAPI可用于染色死细胞。使用摄像头和软件使计数可靠，并且比血细胞仪更加直接。

如果死细胞是样品中的主要问题，则有商业上可用的富集套件，可用于以类似于使用珠子的基于抗体的排序来“清理”样品。这些套件效果很好，可以极大地改善样品染色，并通过最大程度地减少不良死细胞的存在减少获取时间和文件大小。

现在，许多公司销售可固定的可行性试剂。从历史上看，如果您想确保在分析中不查看死细胞，则会添加一个死细胞歧视剂，例如碘化丙啶或7AAD。然而，这些试剂仅处理现场样品 - 经过漫长的隔离细胞和染色样品后，您想做的最后一件事就是在午夜运行样品！可固定的生存力试剂很棒，因为它们可以在染色之前使用然后固定。然后可以将样品存储过夜，并在第二天运行，当时机器上可能有更多时间，您有更多的能量！能够修复样品也使它们从生物安全的角度更安全地处理。

5.红细胞和碎片

红细胞（RBC）在许多生物系统中都很丰富，从样本采集的角度来看可能是有问题的。在大多数样本类型中，RBC的数量超过了〜1000：1的比率，并且可以掩盖我们感兴趣的事件。它们可以相对简单地使用渗透裂解步骤删除，但是要当心 - 某些裂解缓冲器可以是对非RBC有害，可能导致细胞类型的损失，例如肥大细胞或嗜碱性粒细胞。

通过分解组织和样品准备过程中死细胞的分解而产生的碎片也可能是一个问题。以与RBC类似的方式，大量碎片可以使细胞识别成为挑战。碎屑更难去除，但可以通过密度梯度离心或使用分类技术（例如富集珠）来完成。

6.从您的流式细胞仪中获得最好的

流式细胞仪样品制备的一个重要方面通常被忽略了，这是对染色条件的优化。使用正确量的样品抗体很重要。对所有抗体进行滴定 - 这似乎是一项昂贵的练习，但最终可能会节省资金，因为您可能需要的抗体比制造商建议的每次测试量要少。公司通常会验证针对可能产生最佳结果的样品的抗体 - 这通常是外周血单核细胞（PBMC）样品。这并不一定意味着这是您感兴趣的组织的最佳集中度。

计算您的细胞。被染色的细胞数量对染色质量产生了重大影响。尽可能确保您始终标记相同数量的单元格 - 这并不总是那么容易。如果您正在使用小型活检或体液，则细胞的数量可能会发生巨大变化，在这种情况下，这是一种优化您期望在样品中可能拥有的最高细胞数量的情况。

总而言之，改善流式细胞仪样品染色的最佳方法是确保您拥有健康的单细胞悬浮液，该悬浮液具有最低水平的死细胞，并且没有RBC和碎屑。使用生存力试剂，以便您可以识别样品中的死细胞并将其从分析管道中删除，以最大程度地减少非特异性抗体结合和聚集体的伪影。最后，花点时间执行对试剂的滴定来设置大量单元格，从长远来看，这将节省您的时间和金钱，并提高质量并允许对您生成的数据进行标准化。

参考

1.沃辛顿生化公司网站http://www.worthington-biochem.com