从药物和食物到身体流体和土壤，分析实验室已经看到了对微克和亚微图的准确测量的需求越来越大数量目标，有时在复杂的矩阵中。尽管这本身并不是卑鄙的任务，但可能需要尽快分析数百个样本，同时确保数据质量增加其他挑战。

耦合液相色谱（LC）与质谱（MS）为分析科学家提供了一种强大的工具来满足这些严格的需求。由于其多功能性和效率，液相色谱 - 质谱法（LC-MS）仪器在许多现代分析实验室中已成为理想的。

什么是LC-MS？

LC-MS是一种分析技术，涉及目标化合物（或分析物）的物理分离，然后是基于质量的检测。虽然相对较新它的敏感性，选择性和准确性使其成为一种选择的技术，用于检测微克甚至纳米图数量的各种分析物，从药物代谢产物，农药和食品掺杂剂到天然产物提取物。

LC-MS如何工作？

LC分离

LC将分析物的物理分离在液体样品或固体样品的溶液中。将一些样品溶液的微量液注入流动流中，称为流动相。而最佳注射体积取决于实验条件，可以使用一A注射到0.1 µl至100 µL的样品中，并使用自动采样器。¹流动相通过柱（不锈钢管）连续泵送，通常填充有另一个液体固定相的二氧化硅颗粒。当样品溶液移动相混合到列时，其成分将根据其化学成分或物理性能而与固定相（保留在柱中）有区别相互作用。基于分析物与固定相之间的相互作用机制，LC分离已分为不同的模式，例如：

- 分区色谱法- 基于与流动阶段相比，基于分析物在固定阶段的不同溶解度和疏水性。

-离子交换色谱- 根据其离子电荷分析分析物。

-尺寸排斥色谱- 利用分析物分子大小的差异将它们分开。

- 亲和力色谱法- 根据分析物与固定相结合的能力分开。

一些分析物将比静止阶段更强烈地相互作用，从而导致它们通过列时的分离。与固定相相互作用最少的分析物首先从列出现。随着流动相继续流过列，其余的分析物被顺序冲洗掉，最后出现的相互作用最强的分析物。特定分析物在列中花费的时间是该分析物的特征，被称为其保留时间（RT）。

LC检测

流出列（洗手型）的流动相通过检测器，该检测器对某些分析物的某种物理或化学特性（例如折射率或光吸收）“响应”。该响应被捕获为信号或“峰”，其强度（峰面积或峰高）对应于样品中存在的组件的量。检测器“看到”分析物的时间是其RT。可以通过将其RT与已知化合物的RT进行比较来确认化合物中的身份。虽然这不是复合识别的准确方法，但当已知一些有关样本的信息时，它会有所帮助先验。

使用MS进行LC检测

虽然多种多样探测器的不同的技术和敏感性已与LC耦合，用于分析不同的样本类型，质谱仪已成为一种选择性，敏感和通用检测器。

与其他探测器不同，携带分离分析物的LC洗脱液不允许流入质谱仪。当LC系统以环境压力运行时，质谱仪是在真空下操作的，两者通过界面耦合。当柱弹液流入界面时，通过施加热量蒸发溶剂，分析物分子被蒸发并蒸发并蒸发电离。这是一个关键步骤，因为质谱仪仅能够检测和测量气相离子。

由于分析物离子是在界面中的大气压下生成的，因此该过程称为大气压力电离（API），界面称为API源。电喷雾电离（ESI）和大气压化学电离（APCI）是LC-MS分析中最常用的来源。

分析物离子被吸引到质谱仪它们受到电场和/或磁场的影响。通过改变施加的磁场来改变离子的飞行路径，以确保其分离基于其质量到电荷（M/z）值。分离后，可以通过多种质量探测器，，，，²其中最常见的是电子 - 塑料。当分离的离子撞击电子形成液的表面（驱动器）时，二次电子就会释放。这些二次电子的乘以级联，通过一系列驱动器级联。测量由二级电子流动产生的放大电流，并在任何给定的瞬间在质谱仪中与质谱仪中的离子浓度相关（图1）。

图1： LC-MS设置的示例示意图。图片来源：CWSZOT，DAGUI1929，CASJU和Yassinemrabet，在下面复制Creative Commons CC0 1.0通用公共领域奉献执照。

绘制LC-MS数据

在LC-MS对样品分析过程中测得的离子的丰度绘制为总离子色谱图（TIC）。该图显示了分析物离子与其RT的峰值强度。此外，色谱图中的每个点都与质谱相关。质谱描述了离子丰度与测量的M/Z值（图2）。

图2： LC-MS分析的示例输出图。信用：丹尼尔·诺雷纳·卡罗（Daniel Norena-Caro），在 Creative Commons CC0 1.0通用公共领域奉献执照。

化合物的质谱不仅提供有关父质化合物质量（来自其离子的M/z值）的信息，而且还有助于阐明化合物的结构同位素质量峰。分析物峰的面积用于定量。

质谱仪可以以两种模式进行操作，a）扫描和b）选定的离子监测（SIM）。在扫描模式下，它设置为在指定的时间段内检测从低M/z到高M/Z值的所有离子。当分析未知样品或没有有关样品中存在的离子的可用信息时，使用此模式。在SIM模式下运行时，将设置质谱仪以测量特定的M/Z值。这是用于精确量化样品中已知化合物的首选操作模式。

将液相色谱与串联质谱法（LC-MS/MS）相结合

通过耦合两个串联运行的质量分析仪，可以进一步改善样品识别和准确的定量。三杆四极质量光谱仪（QQQ或TQM）和四极杆飞行时间（QTOF）是最常用的串联质谱仪。这些配置为样本分析提供了几种可能性。

TQM由两个四极质量分析仪组成（Q₁和问₃）由碰撞电池分开（q/q₂）。Q₁和问₃用作质量分析仪在质量范围内进行扫描或监测特定M/z值的离子，碰撞电池用于碎片碎片在Q中分离的前体离子₁通过使它们与中性气体（例如氩气，氦或氮）进行高能量碰撞。可以操作TQM在四个不同的模式中⁵（图3），即：

- 前体离子扫描- 第一个四极杆（q₁）在质量范围内扫描以选择特定产物离子（m/z值）的前体，然后在最后一个四极杆中监测（q₃）。

- 产品离子扫描- 问₁设置为仅将预定义的前体（M/z）传输到碰撞单元，而q₃在质量范围内进行扫描，以识别在实验条件下获得的片段。

- 中性损失（NL）- 两个Q₁和问₃扫描以通过从所有前体中丧失相同的中性（未充电）物种来识别产生产物的所有前体。Q的扫描范围₃被NL值所抵消。

- 选定的反应监测（SRM）- 两个Q₁和问₃设置为监视前体和产品离子的特定M/Z值。由于其特异性和灵敏度，因此首选该模式用于化合物定量。可以操作TQM，以监视相同和不同分析物的多个前体到产物对产物的转变。

图3： TQM的操作模式。

片段化取决于分子的结构和实验条件，例如气压和碰撞能。因此，在特定的反应条件下，片段化模式与化合物RT及其准确的质量值一起使用。此外，对特定片段离子的监测有助于提高检测的敏感性，从而量化较小量化合物的量。

QTOF质谱仪具有四极质量分析仪和由碰撞电池分离的飞行时间分析仪。四极可用于传输离子或隔离特定的前体离子，然后在碰撞电池中碎片。首先，将一小部分离子脉冲到TOF分析仪中，然后通过施加高压通过施加高压加速无效区域。具有不同m/z值的离子在飞行管中的不同速度以不同的速度传播，并相互分离。TOF Mass Analyzers提供高质量分辨率，同时能够迅速在大型范围内进行扫描。

LC-MS分析

LC-MS已广泛用于分析各种基质中的小分子和大蛋白分子。该技术应用的一些示例是：

- 定量活性药物成分中的遗传毒性杂质⁴

- 在呼出的呼吸中检测代表特定类别掺杂剂的特定类别掺杂剂的化合物，例如合成代理和模拟剂⁵

- 定量生物液中的药物代谢物

- 在食物材料中发现掺假剂⁶和饮食补充剂⁷

- 确定烷基苯酚乙氧基化（APEOS）⁸

- 在游泳池和河水样品中量化个人护理产品⁹

- 定量核苷酸及其在细菌细胞中的衍生物¹⁰

- 定量蛋白质组

- 作为对检测SARS-COV-2¹¹

该技术也已用于分析饮用水，，，，石化，，，，土壤，，，，生物制药，，，，食物和葡萄酒，并检测每氟烷基物质（PFA）和农药残留物。

LC-MS的优势和局限性

优势

LC-MS适合分析极性和非极性化合物以及热图分子。这些化合物的范围从M/Z值<1000 DA的低分子质量分析范围到具有M/Z值> 100,000 DA的非常高的分子质量蛋白。化合物的“软电离”主要给出了分子离子和同位素峰，这有助于确定分析物的精确质量和推定公式。当与碎片光谱结合时，可以阐明分析物的结构。

尽管通常需要几毫克的纯化合物进行LC-MS分析，但只有1 mg就足够了。通过以SIM或SRM模式操作MS，可以在NG/ML甚至PG/ML的范围内实现检测限制。由于仅在SRM模式下监测特定离子，因此即使对于复杂矩阵中的分析物，也可以达到选择性。

限制

LC-MS仪器拥有，操作和维护价格昂贵。运行工具并分析数据需要专业知识。与其他分析技术相比，样品吞吐量是中等的。由于获得的光谱取决于包括仪器类型在内的实验条件，因此通过与参考光谱进行比较的化合物识别范围是有限的。由于质谱仪是破坏性检测器，因此必须在处理可能不容易获得或不可获得大量可获得的样品时要注意。作为一种基于实验室而不是场地技术，LC-MS对不稳定或反应性样品的分析可能会具有挑战性。

由于只能将液体样品注入到色谱柱中，因此必须将实心样品溶解在合适的溶剂中，或者必须从样品中提取分析物。通过液体液体提取（LLE）或固相提取（SPE）等技术进行样品制备对于从复杂样品（例如血浆，食物和土壤）中提取目标分析物至关重要。¹²这不仅有助于提高分析的敏感性，还可以减少系统的污染（在下一节中讨论）。

LC-MS的常见问题

尽管LC-MS赋予复杂矩阵中的痕量分析的几个优点，但必须采取一些预防措施来克服以下挑战在使用此技术的同时。¹³

污染

分析的敏感性，选择性，可重复性和分辨率受到污染物的影响，例如金属离子，邻苯二甲酸酯，聚乙烯甘氨酸（PEG），滑移剂，水和从各种来源进入系统的颗粒，例如：

- 试剂和溶剂
- 用于准备缓冲区的水
- 化学物质从玻璃器皿中浸出
- 微量离心管
- 入口过滤器
- 溶剂线
- 仪器部件，例如泵密封
- 用于脱染的气体在源和碰撞电池中使用
- 样本本身

污染物可以通过：

- 抑制或增强源中分析物的电离
- 与分析物形成加合物
- 掩盖分析物峰和/或出现在色谱图中的幽灵峰
- 使基线嘈杂
- 弄脏系统和列，需要频繁维护和更换零件

最大程度地减少污染：

- 高纯度溶剂，水和试剂应用于制备移动相。
- 新鲜准备的移动相必须用于最大程度地减少对流动相和乙腈（ACN）聚合的微生物污染的机会。
- 应避免使用肥皂或清洁剂清洁玻璃器皿，因为它们可能很难去除，并且在分析过程中可能会引起干扰。
- 必须使用高纯度气（例如，纯度的常用氮气> 95％）。
- 必须妥善维护氮气发生器，并且当压力降至可接受的水平以下时，必须更换气缸。
- 必须从样品矩阵和色谱参数中提取分析物优化为了改善分析物峰从干扰峰的分辨率。

矩阵效应

在分析生物样品时，其他样品成分可以抑制或增强分析物在来源中的电离。为了最大程度地减少矩阵的影响，应将目的分析物与之隔离。因此，样品制备是LC-MS分析的重要先决条件。尽管这会降低基质效应，但很难仅从矩阵中提取分析物。为了防止共同精选干扰化合物，色谱参数也可以优化。在无分析矩阵（矩阵匹配）中制备标准溶液也有助于解释矩阵效应。经历相似的电离抑制或增强的同位素标记的内部标准已知的浓度用于补偿基质效应。

结转

由于样品残留，分析物峰可能会出现在高浓度样品后进行的空白注射中。必须通过使用清洁方案（例如重复的空白注射，针洗和柱条件）来解决这一点，以确保保持分析的灵敏度。

样本损失

分析物（例如蛋白质和DNA）可能由于与实验室消耗品的非特异性结合而丢失，例如微输出管的内表面。分析物的吸附会影响测定的准确性和精度。通过使用表面粘附较低的容器，可以最大程度地减少分析物损失。另一种方法是添加阻断剂，以最大程度地减少分析物与容器内表面的相互作用。¹⁴

流动相缓冲区选择

由于必须在MS分析之前删除色谱柱洗脱液，因此只能用于制备移动相。

维护

必须按照预定的时间表进行定期维护质谱仪，以确保仪器的准确性，可重复性和无故障运行，并最大程度地减少计划外的停机时间。

参考

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