寻找用于治疗和预防共同19的药物，导致重新利用可用的小分子药物，例如remdesivir，并开发了许多新的新型药物毒品和疫苗。¹许多新疗法都是生物制药，1982年创造的术语。²这些生物制剂或“大分子药物”，例如治疗蛋白，单克隆抗体，寡核苷酸和抗体 - 药物结合物，已成为治疗多种疾病的宝贵工具。这包括癌症，类风湿关节炎和牛皮癣，有效的小分子疗法受到限制或不可用。

与化学生产的小分子药物不同，生物药物是源自活细胞（微生物，动物，植物或人）的。复杂的制造过程可能导致目标分子结构的异质性或变化，这可能会影响分子的功效，安全性和稳定性。因此，为确保以所需的纯度形成正确的化合物，对过程的持续监测以及产品质量至关重要。这涉及从该过程获得的变体的深入表征。此外，制造过程中药物和/或用宿主细胞蛋白的制剂的污染，或在存储或运输过程中形成的靶分子的分子片段或骨料的污染需要定期分析。

此外，预计将与创新者产品相同的大量“负担得起的”生物仿制药也需要测试来评估其与原始产品或参考产品，质量和功效的相似性。生物制药的各种途径影响其药代动力学，因此体液中的治疗药物监测变得很大。

生物制药中如何使用液相色谱法？

尽管液相色谱（LC）与质谱（多发性硬化症） （LC-MS）是一种强大且常用的技术，用于在药物开发过程中表征生物药物的特征紫外线可见（UV-VIS）/光电二极管阵列（PDA），荧光和光散射检测器用于常规分析。已经开发了各种LC方法来评估这些分子的关键质量属性，例如对生物治疗分子，聚集和电荷变体的纯度和化学修饰，以及在复杂矩阵中量化它们并确保缺乏杂质。下面列出了此类方法的一些示例：

• 肽映射是一种公认​​的技术鉴定蛋白质，监测其结构完整性，并确定一级结构中的任何氨基酸修饰。它涉及用胰岛等酶的蛋白质消化，然后是S其碎片的范围和识别。已经开发了使用反相（RP）色谱法（RP）的快速肽映射方法，或带有紫外线检测的RP高性能液相色谱（HPLC），用于估计单克隆抗体中的位点特异性氧化。³
• 尺寸排斥色谱（SEC）用于根据溶液的大小或分子量分离分子。具有紫外线或光散射检测的SEC是研究蛋白质和抗体聚集的选择，或者在制造或随后处理过程中分子的分解。已经开发了一种SE-HPLC方法，用于对病毒疫苗和病毒样颗粒（VLP）的质量控制。⁴
• 离子交换色谱（IEX）具有紫外线检测的（IEX）可以检测到电荷变化的存在。IEX还可以帮助科学家了解本地状态中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。⁵
• 疏水相互作用色谱（HIC）用于通过使用疏水性分离生物分子来纯化生物分子。该技术已应用于将药物级超卷的质粒DNA与其他同工型分开。⁶与RP-HPLC结合使用HIC已用于分析抗体 - 药物缀合物。⁷
• LC技术（例如RPLC，HIC，SEC和多维分离）已用于确定药物与抗体比率，评估药物负荷分布并分析抗体 - 药物 - 药物偶联物中与过程相关的杂质。⁸
• 与单克隆抗体相连的聚糖或糖的特征是LC分离后荧光或MS分析。⁹
• LC-MS通常用于分析生物制剂中的翻译后修饰，例如蛋氨酸氧化或脱胺。最近的一项研究使用了未靶向的LC高分辨率（HR）MS来检测通过差分分析向单克隆抗体转化。¹⁰
• 亲和力色谱法基于生物分子及其配体之间的特定相互作用，用于隔离和滴度（浓度）测定。¹¹
• HPLC已被证明适用于生物仿制药的常规合规性测试。¹²
• 除了一（1D-LC）和二维LC（2D-LC），多维LC（MD-LC）外，还开发了使用相同LC系统的在线样品制备与多级别的测定法，以用于生物药物分析。¹³
  
  除了表征和量化生物治疗剂外，LC还用于分析赋形剂，¹⁴从预填充的注射器收集的治疗蛋白制剂中，诸如浸出的硅油等杂质，¹⁵以及生物制剂的纯化。¹⁶

色谱在药物分析中有什么意义？

在生产过程中，生物药物容易受到其结构改变的影响。例如，在细胞培养期间，蛋白质结构可以通过：

• 氨基酸残基的甲基化，磷酸化或糖基化
• 二硫键争夺
• 脱真正
• C末端赖氨酸或精氨酸裂解

这需要将变体彼此之间以及媒体和杂质分开。LC是为此目的的有效工具。此外，大多数生物药物具有紫外线活性或具有发色团，使其可通过UV-VIS/PDA探测器进行检测。使用RP-HPLC确定蛋白质的主要结构消除了执行时必时间的需求埃德曼退化确定氨基酸序列。与用于分析抗体的常规技术相比酶联免疫吸附测定法（ELISA），HPLC提供了一些优势，例如较低的检测限，适用于定量分析和更好的可重复性。此外，与ELISA的情况一样，对抗体的可用性没有依赖性。LC对疫苗的表征是昂贵且耗时的动物测试，ELISA或分析性超速离心的可行替代品。

在大多数实验室中，HPLC仪器的可用性，易于操作和维护的易用性使色谱成为常规分析的理想技术。上面提到的LC的形式范围使其适合表征生物药物的不同方面。使用超高性能液相色谱（UHPLC），可以提高分析速度。进一步的可用性生物恩UHPLC组件的版本使其非常适合对生物制药的快速和常规分析。

是什么使生物制药样品对LC充满挑战？

生物制药的分析由于其：

a）与小分子药物相比，尺寸相对较大

b）物理特征，例如蛋白质和肽分子的多个电荷状态

c）微生物性

这需要使用多种正交技术进行完整的表征。一些可能影响药物安全性和效力的结构变体可能以低浓度存在。结果，样品制备以分离低丰度蛋白是生物药物分析的关键步骤。有时，可能需要从头开始评估新型的生物药物，因为文献中可能很少获得信息。这可能需要使用通用检测器，例如质谱仪进行初步评估。此外，对于检测非uv的修饰，杂质或赋形剂，可能需要互补的技术。

尽管HPLC是对良好生物药物的常规分析的理想选择，但必须考虑一些因素以确保更好的色谱法。为了最大程度地减少或消除生物分子与流动路径的粘附并与金属离子（特别是铁或钢）相互作用，建议根据标准操作程序（SOP）或使用生物启动HPLC系统的周期性钝化流道路。。除了保留分子的完整性外，使用生物互联系统还消除了由于长期暴露于高盐浓度或高pH值的缓冲液而导致的样品流道中金属成分的腐蚀。这些系统具有由惰性材料制成的样品流动路径，例如钛，PEEK（聚醚酮，工程塑料）或陶瓷，可抵抗氧化和腐蚀。

对于生物制药分析，需要具有适当的化学成分和尺寸的列来进行不同类型的分析。RP柱具有较大的孔径和短烷基链以进行完整的蛋白质分析，而SEC和IEX色谱柱分别用于尺寸 - 排除和离子 - 交换色谱应用。亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱是聚糖分析的首选，并且使用C18-RP柱进行肽映射。对于几乎所有这些应用，生物启动柱可用于最大程度地减少非特异性结合并提高可重复性。

色谱参数（例如流速）被优化，以实现良好的分辨率和灵敏度；调节移动相的离子强度和pH值可确保分析物的溶解度，使其与柱上的自由硅烷酚基团的相互作用最小化，并保持生物分子的活性。保持最佳色谱柱温度很重要，因为生物分子在升高温度下易于变性。SEC列必须使用已知尺寸和重量的合适标准进行校准。需要敏感的检测器来检测和鉴定低丰度蛋白和较小的修饰。

结论

LC格式和色谱柱性能（包括RP，SEC，IEX，Hilic，HIC，HIC，亲和力或制剂）以及与各种检测器结合的能力，例如UV-VIS，荧光，荧光，光散射和MS，有助于使LC使LC对生物制药的关键质量属性的常规分析的理想工具。

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