色谱法是分离的科学感兴趣的分子识别、量化甚至净化他们。目标分子的性质如溶解性、大小或疏水性产生不同的模式与固定相之间的相互作用,或不同类型的色谱分离,如反向阶段(RP)、尺寸排阻色谱(SEC)或者疏水作用色谱(嗝)。

离子交换色谱法(IEX色谱法)是什么?

离子交换色谱法,或IEX一类液相色谱法(LC)用于分离有机和无机分子。特别有用的一个领域,本文的重点,是带电生物分子的分离,包括氨基酸、蛋白质、碳水化合物、核酸。分子如蛋白质有一个独特的三维结构,因此具体得团体在他们的表面。因此,净表面电荷在任何给定的pH值是独一无二的一个分子。这个特点是利用分离分子基于他们的交互与固定相的相对带电粒子和随后释放pH值列通过修改或流动相的离子强度。

之间的区别是什么离子交换色谱法和离子色谱法?

在文学中,术语“离子交换色谱法”和“离子色谱法”(IC)通常可以互换使用,但由于IEX的广泛使用,和引用的分离极性或离子物种。然而,集成电路真的是一个总括的术语,它包括IEX以及离子排斥色谱法(IEC)和离子对色谱法(IP)。IEX,包括优惠绑定的带电的电荷相反官能团分析物固定相,是主要的机制用于生物分子的分离。¹IEX使用缓冲区包含盐流动相;分离是通过改变离子强度或带来的洗脱液的pH值和检测执行使用紫外线(UV)或荧光探测器。另一方面,IC也更广泛用于无机离子的分离,小有机酸、胺、醇、醛类和碳水化合物的三种模式,IEX, IEC或IP。对于这些类型的分析物,电解方案用于洗脱和抑制电导测量集成电路的最常用的检测技术。

离子对色谱法也可以被视为一种分配色谱法在感兴趣的分析物的筛选了一个中立的固定相的帮助下电荷相反试剂离子或离子对试剂。通过改变流动相的离子对试剂的浓度,分析物的保留时间不同,导致了他们的分离。

离子交换色谱法是如何工作的呢?

生物分子基团,在溶液中电离并传授特定分子净电荷。例如,蛋白质是由氨基酸的氨基(nh₂)和羧酸基团(羧基)。蛋白质的三维结构决定了哪些氨基酸残基的接触表面。取决于介质的pH值,这些残留物电离,使表面分子积极和消极指控。在低pH值,更多的氨基质子化了的,蛋白质分子携带净正电荷。另一方面,pH值更高,更多的羧酸团体deprotonated和由此产生的阴离子使蛋白质分子的表面带负电。的总数电离表面官能团存在决定了净表面电荷,每个分子都有一个独特的表面电荷在任何给定的pH值。蛋白质是电中性的等电点(π),这是一个特定的pH值,它没有净电荷的分子。

图1显示了一个由IEX分离机制。当极性或带电分析物被加载到一个离子交换柱,他们是静电绑定到电荷相反的离子出现在固定相表面的粒子。积极或消极指控越大表面的分析物分子,越强的静电吸引相对固定相的带电粒子。目标分析物的保留时间也取决于数量的与固定相的相互作用。水移动阶段包含缓冲区和盐是用来洗提保税分析物不同pH值或离子强度。

图1:示意图显示IEX通过增加分析物分离洗脱缓冲液的离子强度。

有五个主要步骤IEX的过程:²

1。平衡——作为第一步,开始的固定相是洗缓冲(初始缓冲组成),直到基线稳定和洗脱液pH值保持不变。这个步骤确保列得组织可以与带电分析物分子。

2。示例加载——样品溶解在开始缓冲或缓冲的pH值缓冲区注入列开始。调整缓冲区的pH、离子强度的分析物虽然杂质不绑定到列。

3所示。洗——列洗再次开始缓冲区删除无电荷的分子以及分子相同的电荷作为固定相。基线稳定一旦杂质冲走。

4所示。洗脱——使用盐梯度洗提绑定分析物离子的洗脱缓冲争夺和替换的分析物表面带电的网站列。在低离子强度、弱约束分析物(分子表面电荷密度较低),开始淋洗的列。随着盐浓度的增加,强烈束缚分子的表面电荷密度越来越高洗提列的顺序。另外,pH梯度可以用来洗提的约束分析物释放列在各自的π值。洗提阳离子,洗脱缓冲液的pH值增加,而阴离子中筛选了阴离子交换柱洗脱缓冲液的pH值下降。pH梯度不能使用,如果一个分子沉淀在其π值。

5。列再生——最后,柱容量恢复在未来由冲刷上的任何分子绑定列。为了达到这个目标,一个高离子强度缓冲允许流过的列,直到基线和洗脱液的pH值稳定。列前然后用起始缓冲条件下运行。

尽管如此,紫外线或荧光探测器在IEX最常用,等探测器质谱仪折射指数(RI)多角度光散射(mal)探测器也被使用。

基于电荷的离子分离,IEX色谱法的两种类型,即阴离子交换或阳离子交换,使用。阴离子交换柱带正电基团共价结合到固定相粒子和阳离子交换剂有带负电荷的官能团键合固定相粒子。正如他们的名字表明,阴离子交换色谱法用于分离阴离子如deprotonated或“酸性”蛋白质分子有更多羧酸团体在他们的表面,而阳离子交换柱用于分离阳离子如质子化了的“基本”蛋白质表面有更多的氨基酸组。

离子交换柱进一步划分为强和弱阴离子和阳离子交换剂取决于他们的离子交换能力。强大的服务器保留他们的离子交换能力在pH值范围宽,因为他们不占用或失去质子与流动相的变化博士而弱交换剂是有效的在一个狭窄的pH值范围电离。表1显示了一些示例,不同种类的IEX列及其有效的pH值范围。

表1:离子交换柱的例子。

列类型	列	官能团	pH值范围
强阴离子交换剂(SAX)	季铵盐(问)	(CH3)3N+CH2O- - - - - -	0 - 14
弱阴离子交换剂(蜡)	Diethylamino乙(DEAE)	(C2H5)2N CH2CH2O- - - - - -	2 - 9
强阳离子交换剂(SCX)	Sulfopropyl (SP)	哟2CH2CH2所以3- - - - - -	0 - 14
弱阳离子交换剂(WCX)	羧甲基(CM)	哟2首席运营官- - - - - -	2 - 9

色谱法的代码,包括两个分离机制如RP和IEX或IEX嗝,使用单一列实现增加分析物的分辨率。

离子交换树脂的选择

IEX列挤满了多孔或无孔,惰性、高分子树脂或凝胶珠基团共价结合。这些团体传递电荷的表面电离状态取决于缓冲流经的pH值列。珠子的材料如右旋糖酐、琼脂糖和纤维素。他们有很高的物理稳定性和均匀大小支持高流量和确保列卷高pH值不会改变或盐浓度。支持珠子的大小和孔隙度中发挥着重要作用的解决指控的物种。

在IEX,选择合适的固定相实现有效分离是至关重要的。的固定相的选择依赖于π和感兴趣的分析物的稳定。如果目标分子稳定在pH值低于其π值,然后阳离子交换剂是首选,但如果目标分子稳定高于其π值,然后一个阴离子交换剂优先。可以使用要么类型如果目标分子是稳定pH值范围宽。

在方法开发,强大的换热器是用来使pH值范围广泛的使用。这有助于加快这一过程。虽然弱转化器的使用有助于提高分辨率当强大的服务器不有效,这些局限性等样品负载能力的变化与pH值和更长的平衡时间。当使用IEX净化时,选择列应该保留目标分析物或杂质由于不同表面净电荷在目标分子和杂质。媒体的选择将取决于所需的净化的程度,从样本捕获到最后的抛光。

离子交换色谱法考虑,优点和局限性

参数影响分离包括:

• 列——随着孔隙度和聚合树脂影响分辨率的大小,选择合适的列来达到良好的分离。较小的粒子大小提供改进的决议,但增加了系统反压力。例如,列挤满了大尺寸的珠子是用于蛋白质纯化的早期阶段,尽管小珠子用于最终的净化流速慢。

• 缓冲区——典型缓冲用作阳离子交换色谱移动阶段包括甲酸(3.8),醋酸(4.6),MES(6.1),磷酸三(8.1),(7.2)或在缓冲区,用作阴离子交换色谱法移动阶段包括三、哌嗪(9.7)和二乙胺(11)。pka提供的值(括号)应该牢记在选择IEX缓冲区。维护所需的pH值、缓冲的浓度通常应在20 - 50 mM。

• 缓冲pH值——对阳离子交换色谱洗脱缓冲pH值保持在4 - 7和阴离子交换的范围7 - 11。选中的pH值必须支持绑定目标分析物的固定相,应该接近其π值使其释放列。以非常低的或非常高的pH值,分析物,尤其是蛋白质,可能强烈绑定到固定相,要求高盐浓度洗脱。此外,一些蛋白质可能沉淀或失去活动高pH值和高盐浓度。开始的pH值缓冲区应该pH值0.5到1单位高于或低于目标分析物的π分别阴离子交换和阳离子交换色谱法。的浓度开始缓冲必须仔细优化,以确保有效的分离。通常,开始缓冲所需的浓度保持列在5 - 20毫米的范围。

• 离子强度/盐浓度——缓冲区包含多达300 - 500毫米的盐如氯化钠、氯化钾、溴化钠、硫酸钠或醋酸钠通常用于洗脱。

• 添加剂——如有必要,尿素等添加剂,添加糖或洗涤剂增加分析物的溶解度,防止其降水或确保分析物稳定性通过抑制酶活性。然而,添加剂可能成为带电工作pH值,可以干扰分离。

• 样品制备——缓冲区的pH值决定了分子的电离状态,样品的pH缓冲是pH值维持在0.5到1.5单位的π值高于或低于感兴趣的分析物。这将确保适当的分子为阴离子交换或阳离子交换色谱法。虽然缓冲区的选择将取决于样本矩阵,开始缓冲是最适合样品制备。如果使用不同的缓冲区,然后它可以交换开始前缓冲区分析。样品出现在高离子强度的解决方案可以稀释缓冲开始加载之前,只要它没有洗涤剂等污染物。粘性样本难以注入和独立;这些必须稀释缓冲。除了pH值,样品的离子强度缓冲扮演重要的角色在实现良好的分辨率。因此,样品必须脱盐及其缓冲区开始交换缓冲区。样品必须在装货前过滤去除颗粒在列。

• 示例加载——最佳分辨率,分析物的质量(s)不应超过的绑定能力列,按照制造商的推荐。

• 梯度——离子强度的运行时间和百分比变化随着时间的推移,必须优化来实现所需的分辨率。通常,一步酸度梯度是优于线性梯度作为后者很难建立准确、重复性良好。

• 流量——尽可能高流量的决议是不可以用来提高吞吐量的影响。可以使用更高的流速在列再生和re-equilibration节省时间。

IEX虽然有几个优点,技术也有一些限制(表2),必须考虑当选择该技术分离、纯化或生物分子的量化。

表2:优势和IEX色谱法的局限性。³

的优势	限制
高承载能力	昂贵的缓冲区和仪表
高分辨率集团感兴趣的分子与其他分子的分离和杂质	进样溶剂必须低离子强度和控制pH值可能需要额外的缓冲交换步骤
可以通过只有一个单独的蛋白质不同带电氨基酸或分子只有微小的差异	弱离子交换柱对pH值变化过于敏感,必须在规定的范围内使用维护能力和解决
可以进行快速分离IEX高流率	Bio-inertLC系统可能被用来防止腐蚀在高盐浓度
高目标分子的复苏中得到净化	集中解决离异后加强蛋白质恢复增加了盐浓度的解决方案可能需要缓冲交换前进一步分析
可以用作各种常用或净化的二维分离。额外的好处是,所使用的缓冲区不变性的蛋白质	耦合与质谱分析(MS)是有限的由于高盐浓度洗脱液

离子交换色谱法的应用

使用的各种LC技术之一分析生物制药,IEX已经广泛应用的分离和净化单克隆抗体(mab)和蛋白质。阳离子交换色谱法与一个盐梯度已被证明是适合的分离电荷的变体马伯西妥昔单抗。⁴的阳离子交换器一个线性pH梯度已被用于常见的净化轻链IgG-like双特异性抗体。这种方法已被证明是成功的分离分子不同的由单个带电氨基酸序列或0.1π的差异。⁵而不是传统的紫外线或荧光探测器,amal探测器可以加上IEX描述蛋白质的数量如短肽、蛋白质与类似的质量或低聚物SEC没有很好解决的。⁶原油分馏分离蛋白质混合物和17岁的蛋白质进行了使用阴离子交换色谱法和线性pH梯度。⁷

增强的安全治疗性蛋白质和抗体IEX用于去除污染物,如下游纯化过程中病毒。阳离子交换色谱法已被证明是有效地消除xMulV, mAb的逆转录病毒模型,在抛光一步生产。⁸也不仅仅是细胞,但细胞组件已经分开了量化或使用IEX净化。基线分离和量化的空和完整的衣壳重组腺相关病毒(rAAV)样本来自多个血清型是通过使用QC-compatible阴离子交换色谱法。⁹带负电荷的细胞外囊泡在羊水(EV)使用弱阳离子交换色谱纯化。¹⁰

除了蛋白质、糖类和核酸也使用IEX失散。聚糖已经分离根据他们使用弱阴离子交换剂唾液酸含量,他们desialylation之前,nano-LC女士和nanofluorescence探测器的分离和检测。¹¹短RNA寡聚物(~ 20即使用混合模式色谱法分析了涉及两个分离机制、离子对RP和阴离子交换在单个列中。¹²

结论

IEX,离子色谱的一种,是一个多才多艺的净化技术,描述和分析大生物分子如蛋白质、抗体或核酸。净表面电荷的分离是基于这些复杂的分子,IEX是一个重要的替代其他技术,如反相色谱、疏水作用色谱法或尺寸排阻色谱法。

引用

1。Acikara ÖB。离子交换色谱法及其应用。第二章。柱层析法,迪恩·马丁和芭芭拉·b·马丁。IntechOpen。2013年。doi:10.5772/55744

2。汗。离子交换色谱法纯化和表征的作用的分子,第14章。离子交换技术,Ayben Kilislioğ陆。IntechOpen。2012年。doi:10.5772/52537

3所示。斯坦顿p .离子交换色谱法。:Aguilar MI。(eds)多肽和蛋白质的高效液相色谱法。分子生物学方法在™。风险中,新泽西:施普林格;2004;251。doi:10.1385 / 1 - 59259 - 742 - 23

4所示。Fekete年代,贝克,Fekete J, Guillarme d方法开发分离单克隆抗体的变异在阳离子交换色谱法,第一部分:盐梯度的方法。J制药生物医学肛门。2015;102:33-44。doi:10.1016 / j.jpba.2014.08.035

5。夏基B, Pudi年代,华莱士·梅奥我钟L,普林茨B,约纳利H, et al。共同轻链的净化IgG-like双特异性抗体使用高线性pH梯度。马伯。2017;9 (2):257 - 268。doi:10.1080 / 19420862.2016.1267090

6。Amartely H,亚伯啊,fiedl的用于检查电子邮件地址,Livnah O, Lebendiker m .耦合多角光散射离子交换色谱法(IEX-MALS)蛋白质鉴定。Sci代表。2018年5月2日,8 (1):6907。doi:10.1038 / s41598 - 018 - 25246 - 6。错误:Sci代表。2019年4月11日,9 (1):6182。

7所示。艾哈迈德T Nfor BK Verhaert PDEM,范Dedem GWK, van der Wielen LAM Eppink嗯,等人pH-gradient离子交换色谱法:一个分析工具设计和优化的蛋白质分离。j . Chromat的。2007,1164 (2):181 - 188。doi:10.1016 / j.chroma.2007.07.010

8。Connell-Crowley L,阮T,巴赫J, Chinniah年代,Bashiri H, Gillespie R, et al。阳离子交换色谱法提供了有效的逆转录病毒抗体纯化过程。Biotechnol。Bioengg。2012;109:157 - 165。doi: 10.1002 / bit.23300

9。Khatwani SL,奶油蛋白甜饼,罗z阴离子交换高效液相色谱法的分离和定量测定空在多个腺相关病毒血清型和全衣壳。摩尔。&中国治疗方法。Dev.2021;21:548 - 558。doi:10.1016 / j.omtm.2021.04.003

10。KosanovićM, MilutinovićB, Goč年代,Mitić,N, JankovićM。离子交换色谱法纯化的细胞外囊泡。生物学技术.2017;63 (2):65 - 71。doi:10.2144 / 000114575

11。师上校H,安布罗西尼,Chiodo F, van Kooyk Y, Garcia-Vallejo JJ。增强多糖nanoprofiling弱阴离子交换制备色谱,轻微的酸desialylation,并与nanofluorescence nanoliquid相色谱分析-质谱法检测。电泳。2013年,34 (16):2350 - 6。doi:10.1002 / elps.201200657

12。江成员M, E,毛B, Zewge D, Foley JP,韦尔奇CJ。寡核苷酸的分离影响因素使用反相/离子交换高效液相色谱法的代码列,j . Chromat。一个。2013;1304:69 - 77。doi:10.1016 / j.chroma.2013.06.050