药物开发是一个漫长而昂贵的过程。一种学习reported in the美国医学协会杂志found that between 2009 and 2018, the average investment needed for a drug to make it all the way through thedevelopment pipeline因此，可以考虑进行监管批准为13亿美元。巨额支出的原因之一是较高的药物衰竭率。研究published in自然生物技术表明，从2003年到2011年，进行临床试验的90％的药物未能获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。多年来，制药行业一直在研究和开发生产力下降，这反过来又加剧了未满足的临床需求。在本文中，我们将讨论如何使用不同的高通量筛选（HTS）方法可以帮助加速药物发现过程。比利时罗马尼亚比分直播

由于可用于筛查的可能的大量化合物，制药公司一直在采用HTS方法，这些方法可以快速且廉价地筛选其化学库，以识别具有针对特定生物学目标活性的最有希望的化合物。通常HTS涉及指某东西的用途automation（例如，液体处理机器人），小型化例如1536孔板格式和大规模数据分析，例如合并人工智能。

“数十年来，HTS一直是药物发现行业的主要内容。比利时罗马尼亚比分直播它允许在非常定制的生化测定中对药物活动进行自动分析。但是，到目前为止，这些有目的设计的测定法的读数仅限于少数目标。”Chaoyang Ye博士who developed a cost-effective RNA sequencing protocol for HTS.

在以下各节中，将突出显示新开发的HTS平台来支持药物发现。比利时罗马尼亚比分直播

通过成像读取荧光

Fluorescence-based assays are a convenient way to visualize biological responses to specific compounds in a high-throughput setting. Based on the fluorescence intensity, the degree of biological activity can also be determined. Fluorescence assays can be designed such that signals are emitted or quenched upon production or elimination of a target molecule. Recently,Cecilia Eydoux，一名研究工程师AFMB实验室和同事创建a fluorescence-based HTS assay for the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) RNA synthesis complex. This complex ismade up蛋白质非结构性蛋白质（NSP）-7，NSP8和NSP12，由于它与SARS-COV-2高度同源，因此有可能被利用作为设计蛋白质合成抑制剂的一种手段。利用已知的蛋白质相互作用，研究小组在NSP-7/8与NSP-12（RNA依赖RNA聚合酶）的关联时创建了一个测定，荧光染料会插入双链RNA以产生荧光信号。

研究人员通过对Prestwick Chemical Library的1520 FDA批准化合物进行筛选来验证他们的测定^®。该化合物库是因为其高化的化学和药理多样性以及人类已知的生物利用度和安全性而被选中。借助自动化的液体处理机器人和荧光读取器进行筛选。基于30％的抑制作用，计算出的命中率为3％，候选药物属于蒽环素和四环素科。

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质谱

化学发光和荧光读数的局限性是它是对生物活性的间接测量。Andreas Luippold博士等。最近发达a HTS method usingmass spectrometry。作者认为，质谱是一种无标签技术，并提供了直接底物与产品转化的证据，这与药物发现更为重要。比利时罗马尼亚比分直播此方法也有降低风险复合干扰可能导致假阳性和负面因素，并且不需要量身定制的信号介质来扩增信号，例如在荧光读数中。但是，到目前为止，将质谱与液体处理机器人整合在一起，并且在质谱仪中使用的缓冲液也可能是具有挑战性的不相容保存蛋白质酶活性。

Luippold和同事配置了矩阵辅助激光解吸/电离（MALDI） - 飞行时间（TOF）设备，并配备了液体处理机器人，使其与1536孔板兼容（或4 x 384孔板）。这使得从测定板和基质溶液和基质溶液中的样品转移到MALDI目标板上，使它们能够筛选出〜4900个抑制剂对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的库 - 一种已知的治疗靶标，用于治疗蛋白质酪氨酸磷酸酶1B。糖尿病和肥胖。作者还对其方法进行了对生化测定和自动斑点技术的正面比较。为了产生100万个数据点（即筛选一百万个化合物/分子片段），MALDI-TOF HTS方法仅需5.1天而不是11天的生化测定法和7天的自动斑点技术。

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Cell systems

Diseases affecting the central nervous system are on the rise but高故障率在CNS候选物中，由于无法通过血脑屏障（BBB），因此仍然存在。CNS药物的成功率是只有7％and it takes roughly10.5 yearsto develop therapeutics in this area, which is significantly longer than other diseases.Elisa Moya博士，最近的Artois大学和同事的研究员发达微型化in vitroBBB model to study the impact of drug toxicity and BBB permeation rates for early-stage drug discovery before embarking expensive preclinical studies.

Moya在这种情况下强调了HTS的一些优势：“在BBB中in vitrofield, at the preclinical study phase, the development of HTS is vital for a number of reasons. For example, it enables researchers to evaluate a large number of drugs/compounds rapidly and is better adapted to the high yields needed in early-stage drug discoveries for CNS compound discovery.” She also notes that their method reduces material and plastic waste and allows researchers to screen out weak candidates early on, thus reducing the amount of further testing required using体内楷模。

“基于专利和公认的人in vitroBBB model created by the University of Artois, we developed a miniaturized and automated replicate. The replicate uses a 96-well system format combined with automated technology,” notes Moya.

团队创建了人类BBBin vitro使用源自从人脐带血分离的CD34+造血干细胞的内皮细胞的模型，并将不同数量的细胞播种到带有井插入的96孔板中。周细胞是BBB的主要细胞类型，也被种植在井板的底部。然后，作者通过分析荧光细胞细胞标记物，荧光素钠荧光素的运输来评估BBB完整性。当Moya和同事比较了手动和机器人创建的BBB完整性时，它们以不同的井板格式可比，这表明形成了紧密的网络。共聚焦成像还证实了粘附蛋白的存在，例如钙粘蛋白和紧密连接蛋白，例如由机器人种子的BBB中的Claudin-5。

接下来，团队筛选了一组药物，例如安非他酮whose values for the free/unbound fraction ratio of the brain/plasma are known in humans体内。结果表明，使用微型BBB模型测试的各个药物的自由/未结合分数比与该药物相似体内人类的数据，具有很强的相关性（r²= 0.8808）。当Moya等。测试了其微型化模型的BBB完整性，他们还发现神经毒性药物像烤面包酮大大破坏了BBB，而BBB完整性不受乙酰氨基酚等非神经毒性化合物的影响，进一步增强了其模型的生理相关性。

“我们已经证明了这一点in vitroBBB模型能够实现预测结果，适合药物化合物的HTS。” Moya补充说。尽管已经证明了其模型的实用性，但重要的是要注意一些关键局限性，包括仅包含两种细胞类型以及缺乏动态流动环境。

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RNA测序

RNA测序是一种了解药物作用的有力方法。这种方法使用RNA转录组作为代理，但是当前可用的技术通常是较低的吞吐量，昂贵和人力密集的。Chaoyang Ye博士和同事为HTS开发了一种具有成本效益的RNA测序协议DRUGseq通过放弃冗长的RNA纯化步骤并采用多重策略。药物治疗后，将细胞裂解，并直接逆转转录（RT）。该团队还将特定的条形码引入RT引物，使他们能够从单个井中汇总cDNA，并减少多孔处理中所需的人工。

为了进一步减少涉及的时间和成本，Ye及其同事还测试了减少读取深度对检测到的基因数量的影响以及药物治疗后捕获差异表达基因的准确性。与每个样品的常规4200万读物相比，药物库以2和1300万读/井进行了测序，即使在浅层读取深度，基因表达式在井之间也保持一致。

Next团队应用了Drugseq筛选一个具有已知目标的433种化合物的库。Drugseq检测到的差异表达基因的数量与来自连接图, a large dataset of cell perturbations due to pharmacological treatments, despite using different technology platforms.

最后，作者使用Drugseq比较了CRISPR敲除和复合抑制良好的化合物Cycloheximide与RPL6的效果。他们发现，尽管CRISPR治疗降低了RPL6mRNA，环己酰亚胺没有。然而，发现两种治疗的转录组谱在机制上更相似，并且与DMSO处理和非靶向对照样品相比，被聚集在一起。作者通过强调了药物的优势而不是竞争平台，例如PLATE-seq具有较低的吞吐量和计算偏差。

“这项工作可以使数百至数千至数千个井的转录分析具有成本效益，并且与工业环境中现有的复合筛选自动化兼容。面临的挑战是，它需要投资于预先筛查自动化，才能真正具有成本效益。转录本捕获效率也可以通过测试各种反应条件来提高，这将提高检测灵敏度并每孔的测序成本降低。” Ye说。

He continues, “We hope that more labs will adopt and improve this technology in the future. As a continuation of the original study, a recentmanuscript现在已提交给生物xiv我的同事们更严格地测试了平台，并使分析工作流程可供公众使用。”

结论

药物发现成功率的持续下降将导致未满足的临床需求比利时罗马尼亚比分直播，并随着制药公司寻求收回其研发投资而更加昂贵的药物。HTS是一种以速度和成本效益筛选庞大复合库的策略。传统方法（例如荧光读数和细胞培养模型）可以与自动成像系统，液体处理机器人和微型化相结合，但通常依赖于间接测量生物学活动，而质谱仪可以整合到HTS工作流程中，以促进对分子碎片和分子碎片和分子碎片和分子碎片和分子碎片的直接测量。活动。最后，随着测序技术的快速进步，预计具有HTS容量的RNA测序将成为一种有力的工具，可以实现新颖的复合机械研究，复合重新验证和对遗传转录网络和CRISPR基因编辑的鉴定。